线虫unc-22突变基因的克隆
实验原理
外源DNA与载体分子的连接就是DN重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA 连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分子与外源DNA分子进行连接。Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基，可以与pMD18-T Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。将携带目的基因的T质粒转入大肠杆菌并对其进行蓝白斑筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
实验试剂
1. Taq DNA聚合酶
2. 安苄青霉素
3. 葡萄糖
4. X-gal
5. IPTG
6. pMD18-T载体
7. LB培养基
8. 溶液I、溶液II、溶液III
9. 苯酚
10. 三氯甲烷
11. 95%乙醇
12. 无水乙醇
13. RNAase A
14. DNA Marker
实验设备
1. 培养皿
2. 涂玻棒
3. 移液枪
4. 枪头
5. 1.5ml离心管
6. PCR 管
7. PCR仪
8. 恒温培养箱
9. 恒温摇床
10. 恒温水浴锅
11. 离心机
12. 无菌操作台
实验步骤
1. 引物设计
从NCBI上下载线虫unc-22基因序列（GenBank登录号：NM_069873），依照此序列用 Primer 5.0软件分别设计上游和下游扩增引物。
2. 目的基因的PCR扩增
25µl反应体系：
模板cDNA 1.5µl
10×reaction buffer 2.5µl
2.5mM MgCl2 2µl
2.5mM dNTP 2µl
上游引物 1µl
下游引物 1µl
Taq DNA聚合酶 0.2µl
加ddH2O至总体积 25µl
按照以下程序进行PCR扩增：
94℃预变性4min；
94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；
72℃总延伸10min，4℃保存。
取5µl PCR产物与荧光染料混合均匀在1%琼脂糖凝胶电泳（1×TAE电泳缓冲液、100V恒压），用凝胶成像系统照相观察，确定所得DNA的大小和纯度。
3. 目的基因片段PCR产物的纯化回收
将PCR产物与荧光染料混合均匀进行1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下用干净刀片切下含目的基因片段的胶带。按照DNA快速纯化/回收试剂盒操作说明，纯化回收目的片段。
4. 目的基因片段与克隆载体的连接
PCR产物经试剂盒纯化回收后，通过T/A克隆的方法，直接与pMD18-T载体连接，连接反应体系如下：
纯化回收的PCR产物 4μl
Ligation SolutionⅠ 5μl
pMD18-T Vector DNA 1μl
混匀后16℃连接过夜。产物可于-20℃保存。
