技术文章

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件：（1）是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有l到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，根据标记，从而知道目的基因是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。由于细菌质粒具备上述条件，因而它已成为基因工程中常用的载体之一。
载体（Vector）：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒（运载工具）。
质粒（Plasmid）：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中zui多。质粒具有自主复制性、不相容性、多拷贝性、转移性、选择性遗传标记、质粒DNA链上有1到几个限制性内切酶单一识别位点等特点。它可独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒类型：
1.严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；
2.松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
一、实验目的
大肠杆菌在LB培养基上培养，用碱性裂解法快速从大肠杆菌细胞中分离、提取、纯化质粒DNA。用紫外吸收法测定质粒DNA含量；用琼脂糖凝胶电泳法鉴定其纯度；用质粒转化实验，检测质粒的生物活性。
二、实验流程
细菌培养物的生长-细菌的收获和裂解-质粒DNA的纯化-质粒DNA的鉴定
大肠杆菌感受态细胞的制备-质粒DNA的转化-筛选转化子和计算转化率
三、实验准备
1、仪器和材料
（1）微量加样器、无菌工作台、高压锅、低温高速离心机等；
（2）1.5mL塑料离心管、枪头、培养皿（需高温灭菌）；
（3）实验材料：大肠杆菌PBLGC，含抗卡那霉素基因质粒。
2、试剂
LB培养基，配2000ml。成分如下：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCI10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用10mol/LNaOH调pH至7．0。高压灭菌30min；pH8.0 GET缓冲液，配100ml。成分如下：50mmol ／L葡萄糖，10mmol／L EDTA （pH8.0），25 mmol／L Tris－HCl（pH8.0）。高压灭菌30min；pH4．8乙酸钾溶液，配100ml。成分如下：60mL 5mol／L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O。高压灭菌30min；0.lmol／L CaCl2溶液：每100 mL溶液含CaCl2（无水、分析纯）1.1g，用双蒸水配制。高压灭菌30min；0.2mol／L NaOH（内含1%的SDS），注：临用时配；异丙醇；7.5mol／LNH4Ac；pH8.0TE缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTA，其中含RNA酶20ug／mL；TBE缓冲液：称取Tris2.18g、硼酸1.1g和EDTA－Na20.14g用蒸馏水溶解后，定容至400mL，称为TBE缓冲液（0.5×TBE）；琼脂糖（电泳用）；EB染色液：将EB溶于蒸馏水或电泳缓冲液，使zui终浓度达到0．5～lug／mL。避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1000倍；40%蔗糖溶液；沿指示剂：0.5%溴酚蓝（BPB）染色液。