质粒DNA的分离、纯化

所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
1、碱裂解法原理:本实验采用 碱裂解法 进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（ SDS SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS 处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体 DNA 。两种 DNA 在强碱环境都会变性。
当加入 pH4.8 的酸性乙酸钾降低溶液 pH 值后，质粒 DNA 将迅速复性，而染色体 DNA 分子巨大，难以复性。
通过离心，大部分细胞碎片、染色体 DNA 、RNA 及蛋白质沉淀（ SDS 的作用下 ）除去，而质粒 DNA 留在上清中 。
再用异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA 。
2、实验材料、主要仪器和试剂
（1）材料：含有质粒PBLG的大肠杆菌DH5α
（2）仪器：塑料离心管架（30孔）；10、100、1000μL微量加样器；1.5mL塑料离心管（又称EPPendorf离心管）；低温高速离心机（20 000 r／min）一台；无菌工作台；高压锅；常用玻璃仪器及滴管等。
（3）试剂：LB培养基成分如下：每升含有胰蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCI10g，琼脂糖或琼脂（固体培养基时用）15g，用NaOH调pH至7.0；pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol／L EDTA，25 mmol／L Tris－HCl）；0.2mol／L NaOH（内含1%的SDS），注：临用时配；pH4．8乙酸钾溶液（60mL 5mol／L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O）：该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol／L；异丙醇；70％乙醇；pH8.0 TE缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTA，其中含RNA酶20ug／mL。
3、操作步骤
1）培养细菌将大肠杆菌PBLG接种在LB固体培养基上，37℃培养12h，挑一个菌斑接种在液体LB培养基上，37℃培养12～16h。
2）从菌落中快速提取制备质粒DNA
（1）在无菌工作台上取1.5mL菌液加入EPPendorf离心管中，转速10000r／min，离心lmin，去掉上清液（注意，一定要吸干上清液）。加入150μlGET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。
注：溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须在使用时新配制溶液。使用EDTA是为了去除细胞壁上的Ca2+，使溶菌酶更易与细胞壁接触。
（2）加入200μl新配制的0.2mol／LNaOH（内含1％SDS）。加盖，颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置5min。
注：SDS能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性。
（3）加入150μl冰冷的乙酸钾溶液（pH4．8）。加盖后颠倒数次使混匀，冰上放置3-5min。
（4）用低温高速离心机，转速为10000r／min，离心5min，上清液倒入另一干净的离心管中。
注：乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物，在冰上放置5min是为了沉淀*。如果上清液经离心后仍混浊，应混匀后再冷却至0℃重新离心。
（5）另取一个Eppendorf管，转入上清，并加等体积异丙醇，混匀，室温放置5min，12000r／min离心5min，弃去上清液。
（6）加入200μl无菌蒸馏水溶解沉淀，再加入1/2体积7．5mol／L NH4Ac，混匀后冰浴3～5min，以12000r／min离心5min。
（7）转移上清至新管中，并加入等体积异丙醇或2倍体积无水乙醇，室温放置5min后以12000r／min离心30min。弃去上清。
（8）沉淀用70％乙醇洗涤一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。
（9）加入20μlTE，使DNA充分溶解，置-20℃贮存,待用。