DNA芯片技术检测基因的表达

实验步骤：
一、靶基因样品的制备
与普通分子生物学实验一样，靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和标记。基因芯片包括大量探针分子，因此，靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的类型和所研究的对象（如mRNA 、DNA等）而决定。对于大多数基因来说，mRNA 的表达水平大致与其蛋白质的水平相对应，因此，对细胞内mRNA 表达水平进行定量检测对于了解细胞的性质与状态十分重要。用基因芯片可以对细胞内大量基因的mRNA表达差异进行检测，其靶基因的制备一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物进行扩增。
待测样品的标记，主要采用荧光分子。常规标记的过程是通过在扩增过程中加入含有荧光标记的dNTP（至少一种为荧光标记的），荧光标记的单核苷酸分子，在转录和复制过程中，被引入新合成的DNA 片段。后者变性后，即可与基因芯片上的微探针阵列进行分子杂交。也可采用末端标记法，直接在引物上标记荧光。即在引物合成时通过应用荧光标记的dNTP制备荧光标记引物，或通过标记生物素，进行荧光标记。
对于阵列密度较小的基因芯片（经常用膜片作为基底）可以用同位素检测法，采用32P标记技术，这样可以运用现在普通使用的同位素显影技术和仪器。但是，在使用同位素靶基因标记法过程中，一些表达量高杂交信号强的点阵，容易在其周围产生光晕，当其周围点阵的杂交信号较弱时，其杂交信号容易受到强杂交信号的掩盖。

二、芯片制备
基因芯片的制备主要有两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法。在片合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。在片合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。目前，已有多种模板技术用于基因芯片的在片合成,如光去保护并行合成法、光刻胶保护合成法、微流体模板固相合成技术、分子印章多次压印原位合成的方法、喷印合成法。在片合成法可以发挥微细加工技术的优势，很适合制作大规模DNA探针阵列芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。美国Affymetrix公司制备的基因芯片产品在1.28*1.28cm2表面上可包含300,000个20至25mer寡核苷酸探针，每个探针单元的大小为10um X 10um。其实验室芯片的阵列数已超过到1,000,000个探针。
基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA探针库，然后通过特殊的针头和微喷头, 分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。这种方式较灵活，探针片段可来自多个途径，除了可使用寡聚核苷酸探针，也可使用较长的基因片段以及核酸类似物探针（如PNA等）。探针制备方法可以用常规DNA探针合成方法、或PCR扩增的cDNA、EST文库等。固定的方式也多种多样。点样法的*性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小的商品基因芯片。

三、靶基因的杂交及其信号的检测
cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与一般常规的分子杂交过程基本相同。在基因芯片的杂交检测中，为了更好的比较不同来源样品的基因表达差异，或者为了提高基因芯片检测的准确性和测量范围，通常使用多色荧光技术。即把不同来源的靶基因用不同激发波长的的荧光探针来修饰，并同时使它们与基因芯片杂交。通过比较芯片上不同波长荧光的分布图，可以直接获得不同样品中基因表达的差异。
人们还发展了其它灵敏度高、特异性好的基因芯片杂交检测方法。例如短序列偶联法。该方法首先将非标记的DNA靶序列与基因芯片上探针阵列进行*杂交，若基因芯片上探针的固定端是5’端时，继续以靶基因为模板，可以在暴露于溶液中的3’-OH上用DNA聚合酶合成上新的带有荧光标记的碱基。通过检测ddNTP可以分辨出靶序列的基因。
美国Nanogen公司提出了一种通过交变电场加速基因芯片的杂交速度的主动式基因芯片。他们利用核酸分子所带的负电性质，通过快速反转电场的极性，使靶基因与探针间产生快速结合和分离。通过控制电场的大小，使得*匹配杂交的核酸分子保留在阵列表面，而非特异性结合的DNA在电场的作用下与探针分离。这种芯片的分子杂交速度可缩短至1分钟以下甚至数秒，因此有较广阔的应用前景。