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DNA实验技术:限制性内切酶消化DNA实验

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2013/7/27 14:14:38

标签: 限制性内切酶 消化 DNA

影响限制性内切酶反应的因素很多。DNA制品中的污染均能抑制酶切活性。这种抑制可通过增加酶作用单位数、增大反应体枳以稀释可能的抑制剂或延长反应时间来加以克服。

实验方法

实验方法原理

进行限制酶切割反应只需简单地将酶和DNA样品放在合适的反应缓冲液温育,其中DNA和酶的量、缓冲液的离子强度、温育温度和时间都依具体的反应而改变。

实验材料

DNA

试剂、试剂盒

TE 酶切缓冲液 EDTA

仪器、耗材

电泳仪

实验步骤

1.  混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中


(1)x μl  DNA

(2)2 μl  10×酶切缓冲液

(3)18-x μl  H2O


(4)20 μl 的反应体积可以方便地用于聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分析。

(5)只要反应混合物中其他成分的比例保持一定,可增减待切割DNA的量和反应条件。

 

2.  加入限制性内切酶(1~5 U/μg DNA)在推荐的温度温育1 h (—般是37℃)。

3.  理论上,1 U 限制性内切酶在推荐的反应条件下,60 min 内可*消化1 μg 纯化的样品。

4.  酶的体积应低于反应总体积的1/10,因为酶液中的可以干扰反应。

 

5.  加入5 μl 电泳加样缓冲液终止反应,进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。


6.  反应也可通过加入0.5 μl 0.5 mol/l EDTA(终浓度为12. 5 mol/l) 以螯合镁离于而终止。

7.  很多酶再65℃温育10 min 可被不可逆灭活,有些不能在65℃热失活的酶在75℃温育15 min 也能失活。

8.  如果酶对热具*抗性,可遍过酚抽提和乙醇沉淀或通过硅基质悬浮法来纯化DNA。

 

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