三、操作步骤
(一)取材、冰冻切片:
将动物以3%戊巴比妥钠麻醉,打开胸腔,暴露心脏,刺破右心耳,将针尖刺入左心室用生理盐水灌注(灌注量约为动物体重的2倍),再注入等量的4%多聚甲醛。(见图2-7)。取材,置于4%多聚甲醛中后固定4hr。以0.1M PBS浸泡冲洗4-5次(换液:1次/hr)。将组织块入30%蔗糖/0.1M PBS液(4℃),1-2天后冰冻切片,将切片裱贴于原位杂交玻片上,切片厚度为15-20μm。
(二)探针制备与检测(定量):
1. 随机引物制备cDNA核酸探针以DIG DNA 标记检测试剂盒为例:
(1)探针制备:
①模板DNA(0.5-3 μg) 15 μl,100℃变性10 min,冰浴5 min。
②在冰浴中加:Hexanucleotide mix 2 μl, dNTPmix 2 μl,Klenow Enzyme 1 μl,反应总体积为20 μl。37℃孵育过。
③在上述20 μl 的标记产物中加4 M LiCl 2.5 μl,75 μl(无水乙醇预冷,轻轻混匀,-20℃放置 2 hr。4℃离心12 000 g×15 min,弃上清。70%乙醇(预冷) 50 μl 洗涤,7 500 g×5 min,弃上清,晾干沉淀,加TE 50 μl 溶解沉淀,-20℃保存备用。
(2)探针敏感性检测:
①样品稀释:取dig-标记探针1 μl 用ddH2O以1:10、1:100、1:1000、1:1000、1:10000梯度稀释。
②取一张与点样器大小相近的尼龙膜,标记方向,ddH2O中浸泡 1 min,6×SSC中浸泡10 min,置点样器上,负压抽吸5 min。
③将上述样品点于尼龙膜上,继续抽吸10 min。
④取下尼龙膜,置紫外灯下10 cm 处照射5 min,晾干。
⑤将膜置于适量预杂交液(5-10 ml)中,37℃预杂交10 min。
⑥加入Anti-dig 抗体(1:5000),37℃杂交30 min。
⑦洗膜:2×SSC/0.1%SDS室温洗10 min×2次。
⑧显色:15 ml TSM2中加300 μl 显色液(NBT/BCIP),37℃避光显色30 min。
2. PCR法制备cDNA核酸探针:
(1) 探针制备:
以PCR DIG Probe Synthesis Kit 为例:
在0.5 ml 离心管中,依次加入:
PCR引物 1(10 pM) 2 μl;
PCR引物 1(10 pM) 2 μl;
质粒DNA 模板(10-100 pg) 2 μl;
PCR DIG mix 2 μl (含dNTP和DIG-11-dUTP);
dNTPmix 2 μl;
10×PCR buffer 5 μl;
Taq 酶(2 u/μl) 1 μl;
加入适量ddH2O,使总体积达50 μl。
① 将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。
一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 45 s → 58℃ 45 s → 72℃ 60 s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7 min。
② 在上述PCR产物中加入4 M LiCl 12.5 μl、预冷无水乙醇375 μl,轻轻混合后置于-20℃2 h,12 000g×15 min,弃上清。70%乙醇(预冷) 120 μl 洗涤沉淀,离心7500g×5 min,弃上清,晾干沉淀,加TE 50 μl 溶解,-20℃保存备用。
(2)探针检测:
行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察DIG-DNA探针含量(采用目测法)。
(三)原位杂交反应(以DIG-cDNA探针为例):
1. 0.1 M PBS (pH 7.2) 浸 5-10 min。
2. 0.1 M甘氨酸/0.1 M PBS 浸5 min。
3. 0.3%TritonX-100/0.1 M PBS 浸10-15 min。
4. 0.1 M PBS 洗 5 min×3次,加蛋白酶K(1 μg/ml),37℃孵育30 min。
5. 4%多聚甲醛浸5 min。
6. 0.1 M PBS 洗 5 min×2次,浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1 M 三乙醇胺中10 min。
7. 预杂交:滴加适量预杂交液,42℃ 30 min。
(1)杂交:倾去预杂交液,在每张切片上滴加10-20 μl 杂交液(将探针变性后稀释在预杂交液中,0.5 ng/μl ),覆以盖玻片或蜡膜,42℃ 过。
(2)洗片:
4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20 min;
0.2×SSC 37℃洗10 min;0.2×SSC与0.1 M PBS各半洗10 min;
0.05 M PBS 洗 5 min×2次。
10. 3% BSA/0.05 M PBS 包被,37℃ 30 min。
11. 滴加抗地高辛-抗血清碱性磷酸酶复合物(以抗体稀释液1:5000稀释)4℃孵育过。
12. 0.05M PBS洗15 min×4次;TSM1 10 min×2次; 新鲜配制TSM2 10 min×2次。
13. 显色:在玻片上滴加适量显色液,4℃避光过。
14. 将玻片置于TE中10-30 min以终止反应。酒精梯度脱水、二甲苯脱脂,中性树胶封片。
15. 显微镜下观察结果。
四、注意事项:
1. 作为DNA-RNA的杂交,需防RNase的污染。
2. cDNA探针在杂交时必须变性解链。具体方法是:将探针置100℃加热5 min,冰浴骤冷
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