MC3T3细胞相关操作-化工仪器网-手机版

MC3T3细胞相关操作：

培养条件：

每两天换液一次

无菌恒温培养箱

37℃

5% CO2

PH值7.2~7.4

*培养基成分: 不含酚红 α-MEM、10% FBS, 0.1 mg/mL L-谷氨酸盐, and 1% 双抗（100 U ml−1 青霉素 and 100 μg ml−1 链霉素）,（ 20 mM HEPES?）

诱导成骨细胞分化：上述+50 μg/mL 抗坏血酸and 10 （5？）mM β-磷酸甘油

细胞复苏

1.37°C水浴预热培养基（αMEM+10% FBS）；

2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；

3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；

4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；

5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养（培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧）；

6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。

细胞传代

1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；

2.37°C水浴预热培养基（αMEM+10% FBS）；

3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞；

4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（αMEM+10% FBS）终止消化；

5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散；

6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；

7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104 cells/cm2 （2.5×105 cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布；

8.将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养。

骨髓间充质干细胞培养方法：

培养基：D-MEM（低糖）（450 mL）、10%FBS（50ml）、10mg/mL庆大霉素（250ul）、0.1 mg/mL L-谷氨酸盐

无菌恒温培养箱

37℃

5% CO2

1、接种细胞后，每48h更换一次培养基。每周传代两次，传代时机选在分裂率为1：3或1：4时进行。通常试验选用3-8传代细胞。

2、细胞鉴定：

①第四传代，去除培养基，加入3 ml of 0.25% （重量/体积）胰蛋白酶/0.02% （重量/体积） EDTA，室温下消化3min。冲洗细胞，加入1 ml冷PBS（4—8℃），4℃下300g离心8min，离心两次。每个离心管中用100ul冷PBS悬浮1×106个细胞，使用抗鼠FITC标记Sca-1, CD11b and CD45抗体染色，或者是PE标记 CD29, CD31, CD34, CD44, CD86, CD105, Ia抗体染色，留一管用作对照。