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兔去甲肾上腺素（NE）ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究研究使用

预期应用

ELISA法定量测定兔血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中NE含量。

概述

肾上腺素（adrenaline,epinephrine,AD）是肾上腺髓质的主要激素，其生物合成主要是在髓质铬细胞中首先形成去甲肾上腺素，然后进一步经*-N-甲基转移酶（phenylethanolamine N-methyl transferase,PNMT）的作用，使去甲肾上腺素甲基化形成肾上腺素。正常肾上腺髓质的分泌物中，去甲肾上腺素仅占10%～18%，但尿中和血浆中去甲肾上腺素约为肾上腺素的5倍。而嗜铬细胞瘤分泌物中去甲肾上腺素可达50%～90%，说明嗜铬细胞瘤分泌的儿茶酚胺以去甲肾上腺素为主。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中NE水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入NE、生物素化的抗人NE抗体、HRP标记的亲和素，经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的NE呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成

1.         酶联板：一块（48孔）

2.         标准品（冻干品）：1瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，其浓度为6.4 ng/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成6.4 ng/mL , 3.2 ng/mL，1.6 ng/mL ，0.8 ng/mL，0.4 ng/mL，0.2 ng/mL，0.1 ng/mL，其原液直接作为zui高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/mL，临用前15分钟内配制。

3.         样品稀释液：1×5ml/瓶。

4.         检测稀释液A：1×5ml/瓶。

5.         检测稀释液B：1×5ml/瓶。

6.         检测溶液A：1×60ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A1：100稀释。

7.         检测溶液B：1×60ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。

8.         底物溶液：1×5ml/瓶。

9.         浓洗涤液：1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。

10.     终止液：1×5ml/瓶（2N H₂SO4）。

标本的采集及保存

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响zui后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1.         加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，轻轻混匀，37℃，120分钟。

2.         弃去液体，甩干，不用洗涤。

3.         每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟。

6.         依序每孔加终止溶液50ul，终止反应。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。测量时先用此孔调OD值至零。

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层

吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
    自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的NE，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．  洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2．  一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3．  请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。

4．  如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。

5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6．底物请避光保存。

检测范围：

0.05 ng/mL -13 ng/mL

说明

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．有效期：6个月

3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。

5．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

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