凝胶层析

凝胶层析(凝胶过滤法)

凝胶层析也称凝胶过滤法，是20世纪60年代发展起来的一种简便有 效的生物化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使 相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物 质分离。
用作凝胶的材料有多种，如交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量 为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。
交联葡聚糖（商品名Sephadex）是由细菌葡聚糖（以右旋葡萄糖为残基 的多糖）用交联剂环氧氯丙烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡 聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小（交联度大，“网 眼”就小），从而得到各种规格的交联葡聚糖，即不同型号的凝胶。“G”表 示交联度，G 越小，交联度越大，吸水量也就越小。
把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中，在加入样品以后，由于交联葡聚糖 的三维空间网状结构，小分子能够进入凝胶，较大的分子则被排阻在交联网 状物之外，因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分 子质量（Mr）大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动，其流程短， 移动速度快，先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒，流 程长，移动速度慢，比相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集 流出液，相对分子质量（Mr）不同的物质便互相分离。SpladexG-10 到G -50 通常用于分离肽或脱盐。G-10 到G-50 通常用于分离肽或脱盐。G-75 到 G-200 可用于分离相对分子质量大于10000 的蛋白质。
交联葡聚糖分子含有大量的羟基，极性很强，易吸水，所以使用前必须 用水充分溶胀。1g 干重凝胶充分溶胀时所需的水量（mL）称为凝胶的得水 值（Wr）。因为得水值不易测定，故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水 性，其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。 2、凝胶柱的总体积（总床体积）Vt 是干胶体积Vg，在凝胶颗粒内部的 水的体积Vi 及凝胶颗粒外部的水的体积Vo 之和。

Vt 也可从柱的直径及高度计算。
Vo 也称外水体积。常常用洗脱一个已知*被排阻的物质（如蓝葡聚糖 2000）的方法来测定，此时其洗脱体积就等于Vo。
Vi 称为内部体积或内水体积，可以从凝胶干重（mg）和得水值Wr 计算： Vi = mg. Wr
Vi 也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物，如铬酸钾 来测定，其洗脱体积等于Vi+Vo。
某一物质的洗脱体积Ve 为：Ve=Vo + KdVi
Kd 为溶质在流动相和固定相之间的分配比例（分配系数），每一溶质都 有特定的Kd 值，它与层析柱的几何形状无关。
如果分子*被排阻，则Kd=0，Ve=Vo。如果分子可以*进入凝胶，那 么Kd=1，Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd 是一个常数（0〈Kd〈1），有时 Kd 可能大于，则说明发生了凝胶对溶质的吸附。
溶质的洗脱特征的有关参数（Ve/Vo，Ve/Vt，Kd，Kav）都与溶质相对分 子质量（Mr）对数成线性关系，先洗脱几个已知相对分子质量（Mr）的球 蛋白，用Ve/Vo 对logMr 对作图，然后在同样条件下洗脱未知样品，从其 Ve/Vo 值，在图上即可找出相对应的logMr，从而进一步算出其相对分子质 量（Mr）。
不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说，在工作范围之内所得的 曲线是线性的，超出工作范围曲线就不成线性。