ELISA* 影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

操作步骤 

可能原因 

解决办法 

  选择试剂 

选择质量优良的检测试剂，严格按照大鼠血管内皮生长因子(VEGF) ELISA试剂盒说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 

加   样 

1.血清或血浆标本分离不好即进行加样； 

2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)； 

3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 

1.标本为血清：将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。 

2.加样后及时放入孵箱。 

3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 

4.如果采用AT或其他全自动加样，选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 

5.标本较多时，请分批操作。 

  孵   育 

1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗*； 

2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗*。 

1.贴封片或加盖； 

2.按说明步骤严格控制操作时间。 

洗   板 

1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。 

2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不*；洗板针堵塞，抽吸不*；洗板不畅，导致洗板效果差。 

3.反应板过多造成洗板等待时间长。 

1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干； 

2.大鼠血管内皮生长因子(VEGF) ELISA试剂盒合理安排，或多用几台洗板机。 

  显   色 

1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂； 

2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。 

1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用； 

2. 加样时保持显色剂不外流； 

3.A、B液应避免接触金属器械。 

  终   止 

加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。 

加终止液时应避免产生气泡。 

读   板 

读板时板底不清洁。 

应保证酶标板清洁。 

全过程 

1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸; 

2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。