细胞裂解与蛋白质定量
Solarbio提供的细胞裂解液：
货号 | R0010 | R0020 | R0030 |
名称 | RIPA组织细胞裂解液 | RIPA组织细胞裂解液 | 非变性组织细胞裂解液 |
有效裂解成分 | SDS，NP-40，脱氧胆酸钠， | 1% NP-40，0.1% SDS | NP-40，Triton X-100 |
裂解强度 | 强 | 中 | 温和 |
蛋白酶抑制剂 | 含, 配有PMSF | 含，配有PMSF | 含，配有PMSF |
产物 | 细胞总蛋白 | 细胞总蛋白 | 细胞总蛋白 |
蛋白状态 | 变性 | 变性 | 保持活性状态 |
主要用途 | WB、IP | WB、IP | WB, IP,co-IP |
本系列试剂随同配送一支PMSF，请收到后-20℃保存。RIPA裂解液4℃保存，如发现有少量沉淀，可常温放置半小时，沉淀可消失，不影响使用。
使用裂解液在提取核蛋白的同时，也会将基因组一并释放出来，细胞量高时会造成细胞裂解液粘稠，此时可以直接加入蛋白上样缓冲液，煮沸再离心，离心取上清直接上样电泳；若想测定浓度，可入加少量SDS（1%），煮沸后离心测浓度。本系列蛋白提取试剂所提取的蛋白由于含有去污剂，所以不适合使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，请选择BCA法或者Lowry法检测蛋白浓度。
如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散粘稠状物，随后离心取上清用于后续实验。
蛋白质定量：
蛋白含量测定是以标准蛋白作为对照，根据蛋白浓度不同，吸光值不同而达到定量的目的。有些方法是理解蛋白本身的吸光值（紫外光谱吸收法）来定量，但更多的是用染料对蛋白进行染色，利用染料与蛋白结合显出与原染料及蛋白不同的吸光值来定量的。后一种方法应用更普遍。
蛋白定量方法的选择，应该考虑到蛋白结构（标准品选择）、蛋白溶液内干扰物等因素的影响。
| Bradford法 | BCA法 | Lowry法 |
原理 | 考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm吸收峰 | 基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu1+，BCA螯合Cu+作为显色剂，产生兰紫色并在562nm有吸收峰。 | Folin－酚法，蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物。 |
灵敏性 | 高 微量:1-10ug/ml, 常规：100-1500ug/ml | 很高 微量:0.5-20μg/ml 常规：20-2000ug/ml | 较高 1-1500ug/ml |
干扰因素 | 强碱性缓冲液 TritonX-100 SDS等去污剂 | 螯合剂 略高浓度的还原剂 （优势：耐受一般浓度去污剂） | 硫酸铵；Tris缓冲液 甘氨酸、各种硫醇 （优势：适用于脂类含量高的样品测定。耐受去垢剂如SDS） |
应用 | 快速5-15min 颜色稳定 标准曲线有轻微的非线性 | 较快40min 较好的方法 抗干扰能力强 | 耗费时间长50min 操作要严格计时 颜色深浅随不同蛋白质变化 标准曲线线性差且专一性差 |
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟20分钟之间，颜色的稳定性好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。
BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。
Lowry法蛋白质测定法是灵敏的方法之一。过去此法是应用广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
