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2010/7/7 9:52:37国立中国台湾大学 生化科技学系 生化研究室 庄荣辉
基础免疫学：
A）脊椎动物体内有催毁外来入侵物体的免疫系统：
免疫反应可分成先天及后天两大系统，又各有两种方式，分别以细胞或分子去扫除入侵物。 当入侵物太多时，即由先天免疫系统诱发后天免疫，开启了更有效率、更为强大的防御机制。
干扰素： 遭病毒攻击的细胞会放出干扰素，干扰素会活化免疫系统。
溶菌： 在体表及泪液中溶解细菌细胞壁。
巨噬细胞： zui基层的免疫细胞，是免疫系统的*线防御。
自然杀手细胞： 可清除体内的癌细胞，是免疫监视系统。
B）后天免疫反应的四个阶段：
遭遇： 巨噬细胞把抗原分解成小片段，专一地表现给TH细胞。
动员： TH细胞动员TK细胞及B细胞，后者生产专一性抗体。
扫荡： 抗体及TK细胞攻击入侵的抗原。
休止： 完成清除抗原后，免疫细胞休息。
C）后天免疫反应的两大特点：
专一性： 由 甲抗原 所诱导的免疫反应只对 甲抗原 有效。
记忆性： *后若 甲抗原 再度入侵，可迅速动员扫荡之。
D）抗体是由B细胞所分泌的蛋白质：
抗体分子： 由四条蛋白质长短炼所组成 （两重两轻）。
结 合 区： 抗体分子上有两个抗原结合区 （二者相同）。
专 一 性： 抗体与抗原结合 专一性 （如lock & key般吻合）。
抗体种类： IgG是单一抗体分子，另有IgM （五元体） 及IgA （二元体）。
为何要使用单株抗体：
1） 抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段，特称之为 抗原决定基 （antigenic determinant）；一个抗原分子上通常都有许多处抗原决定基，而每个决定基至少都可诱生出一种抗体；因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别对抗这些不同的决定基。
2） 对于分子构造相似的抗原，由于它们含有共同或相似的抗原决定基，所产生的抗血清对这两种相似的抗原都会产生反应；因此在检定此类抗原时，其 专一性 不很理想，常常会出现假阳性，也称为 交叉反应性。 同时又由于免疫动物的个别体质不同，对抗原的反应也有相当的差异，以致无法准确控制所得到每批抗血清 效价 的高低。
3） 血清中的每一种抗体是由单一个B细胞所分泌产生，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种 抗原决定基 反应，其专一性*。 大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为 单株抗体。
4） 然而B细胞不易在培养基中生长，虽然有人一直努力，想找出在体外培养脾脏细胞的条件，但结果均不甚理想，因此上述想法不易达成。
5） 癌细胞的生长不受控制，很容易在培养基中生长，有很多已经建立好的癌细胞株，其生长特性均已了解； 若把癌细胞永续生长的特性，利用细胞融合法导入可生产有用抗体的B细胞中，则得到可在培养基中*生长的B细胞株，此即 融合瘤 细胞株。
6） 广义来说，细胞融合也可说是 基因重组 的一种，它是以融合两种不同遗传特性的细胞，来达成改变遗传形质的目的。 另外，微生物或植物的细胞，亦可以 原生质体 的形式互相融合，以改变其遗传性质。
细胞融合法： 实际操作流程请参考 水稻蔗糖合成脢之研究
利用polyethylene glycol （PEG） 进行小白鼠 脾脏细胞 与 骨髓癌细胞 融合，经过 筛选 及 单株化 后，可得到分泌有单株抗体的融合瘤细胞。
A）小白鼠免疫及脾脏细胞：
小白鼠 （BALB/c） 先以目标抗原 （如菌体） 免疫，抗原需加 佐剂 （adjuvant） 制成乳剂，打入小鼠体内慢慢释出，诱使B细胞成熟增殖并生产抗体，然后取出脾细胞 （大多为B细胞） 与骨髓癌细胞进行细胞融合。近来有人直接取出健康的脾细胞，在试管中加入抗原进行体外免疫；或打开腹腔直接在脾脏注射抗原免疫。 但除非抗原来源困难或有其它目的，一般仍实行旧法，因免疫反应的启动机制非常复杂，不单是靠脾脏而已。
B）骨髓癌细胞 （NS-1）：
NS-1是稳定的小白鼠BALB/c癌细胞株，除了能在培养基中永续生长外，尚有一重要特性，其细胞缺乏两种核酸代谢的重要酵素 （TK, thymidine kinase及HGPRT, hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransferase）。一般细胞内的核酸合成路径有两条，如下图 （1） 及 （2） 所示：
核酸的 正常代谢途径 （1） 若被aminopterin阻碍，可由 （2） 救急途径 （salvage pathway） 取用thymidine及hypoxanthine来合成DNA。 但NS-1缺乏TK及HGPRT两种酵素，因此在aminopterin存在下，NS-1无法生长；正常细胞 （如B细胞） 则可经由 （2） 救急途径 继续生长。 HAT培养基因含有aminopterin, thymidine及hypoxanthine，NS-1在HAT中无法生长，除非经由细胞融合导入TK及HGPRT两酵素的基因 （可由正常脾脏细胞得来）。
C）细胞融合：
小白鼠脾脏细胞⊕与NS-1细胞⊙以PEG进行融合，操作在10 min内完成，随即把细胞平均分配在96槽细胞培养盘中。由于融合是随机的，故可能的组合有：⊕-⊙, ⊕-⊕, ⊙-⊙, ⊕-⊕-⊕, ⊕-⊕-⊙....；只有同时含有⊕与⊙的融合细胞才会活下去：
1） 若只含NS-1 （⊙, ⊙-⊙.....），则在HAT中会因DNA合成抑制而死亡。
2） 若只含脾细胞 （⊕, ⊕-⊕, ⊕-⊕-⊕......），则在体外培养会渐渐死去。
3） 可能活下去的细胞 （⊕-⊙, ⊕-⊕-⊙, ⊙-⊙-⊕.....） 含有来自两方的染色体，同源染色体可能发生基因重组，互换遗传讯息；接下去的细胞分裂会排除多余的染色体，一直到只剩一组染色体时才告稳定。在初期的分裂增殖过程中，失去含有重要基因染色体的子细胞可能会死去。成功稳定的融合细胞株会经由染色体的重组，得兼有双方的特性： 即可分泌抗体，亦可在培养基HAT中生长下去。
D）筛选方法：
1） 初步筛选： 融合后马上以HAT培养，能活下来的都是上述B细胞与NS-1的正确融合细胞，但此时细胞的遗传背景尚未稳定。
2） 筛选专一性抗体： 并非所有B细胞都会产生我们所要的抗体，小白鼠原先就存在许多B细胞株以对抗一般疾病； 因此要用 酵素免疫分析法 （ELISA） 挑出专一性抗体 （请见下图）。
3） 单株化： 这样所挑出来的细胞株，也许仍含有两群以上的细胞 （为什么？），因此要进行单株化；先将该细胞株稀释，重新平分到96槽细胞培养盘中，以计算使得每槽中只含有一个细胞，俟其生长成群落后，再次以ELISA筛选专一性抗体。
E）抗体生产：
1） 可把挑选出来的融合细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后收集所产生的 腹水，腹水中的抗体浓度非常高，每mL可达数mg。
2） 把融合细胞在大型培养槽中培养，收集培养液上清即得抗体，但每mL只得约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。
3） 所得到的抗体再经纯化步骤，以除去杂质，可用下列各种方法的组合︰
硫酸铵分划： 收集约40% 饱和度的沉淀，是、方便的方法。
离子交换法： 用DEAE阴离子交换法，多用在纯化IgG。
胶体过滤法： 以分子量的差异分划出各种抗体，多用在纯化IgM。
亲和层析法： 以Protein A-吸着剂 专一性地吸住抗体分子 （IgG）。
当单株抗体刚被发展出来时，人们因为它像巡弋飞弹般的准确性，而对其应用于癌症的治疗方面抱以*的希望；但是二十年来，并无突破性的进展。主要的原因，并不是单株抗体无法攻击癌细胞，或者是单株抗体的专一性不够；原因之一乃是癌细胞的变化实在太大，无法找出各种癌细胞的共同抗原，以制成通用的抗癌单株抗体。虽然如此，单株抗体并没有失去其科学上或医疗上的价值，它仍然是一个有用的工具，可以辨认分子上细微的差异，而被应用在很多其他方面；是目前的生物技术产业上，极重要且获利率高的科技。
