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相差显微镜是根据试样的什么性质进行观察的？
相差显微镜的主要缺点是什么？
当载玻片或盖玻片有厚薄不匀等缺陷时，为什么说对相差显微镜观察的影响比普通显微镜大？从传统上说，合金是指金属合金，即在一种金属元素基础上,加入其他元素,组成具有金属特性的新材料。所谓高分子合金是由两种或两种以上高分子材料构成的复合体系，并非指真正含金属元素的高分子化合物，而是指不同种类的高聚物,通过物理或化学方法共混,以形成具有所需性能的高分子混合物新材料。在高分子合金中，不同高分子的特性可以得到优化组合，从而显著改进材料的性能，或赋予材料原不具有的性能。

高分子合金制备简易，并且随着组分的改变，可以得到多样化的物理性能。制备高分子合金的方法主要分化学方法和物理方法两大类。其中物理方法比较简单，如溶液共混法，即将两种以上高分子溶液混合在一起，然后蒸去溶剂即可以得到混合均匀的高分子合金；熔融共混法，即将两种以上高分子加热到其熔融温度以上，采用机械搅拌的方法让其混合均匀，然后冷却即得到高分子合金。化学方法主要有共聚、接枝和嵌段等方法；所谓共聚是指在合成过程中引入第二、第三单体，这样聚合得到主链含有不同单体重复单元的聚合物；接枝是指在某一聚合物主链上，采用共价键联接的方法将另一种聚合物的链段键接上去，形成了一种带支链结构的聚合物；嵌段聚合物指两种以上不同聚合物的线性链间有共价键相连而形成的含多组分聚合物。表1总结了一些高分子合金的制备方法。
表1高分子合金的制备方法
 

与绝大多数金属合金都是互容的均相体系不同的是，大多数高分子合金都是互不相容的非均相体系，而组分的相容性从根本上制约着合金的形态结构，是决定材料性能的关键。如何改善共混物组分间的相容性，进而进行相态设计和控制，是获得有实用价值的高性能高分子合金材料的一个重要课题。对合金的织态结构形态、尺寸的研究对制备高性能高分子合金具有重要的意义。高分子合金织态结构的研究方法主要有电子显微镜法、光学显微镜法、光散射法和中子散射法等。光学显微镜法zui为简单易行和直观，其中相差显微镜(也称相衬显微镜)适合于观察0.5mm以上的相态结构。
1. 目的要求
了解相差显微镜的原理和使用方法。
制备聚苯乙烯（PS）/聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）合金薄膜。
用相差显微镜观察不同配比的PS/PMMA合金薄膜的相结构。
相差显微镜原理
2.1相差显微镜原理
相差显微镜是荷兰科学家Zermike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
普通的显微观察是根据物体对光线的不同吸收来区别的，即图像的反差是由光的吸收差异产生的。对于单色光的场合，样品各个结构部分由于对光线吸收大小不同而显示出不同的亮度，也就是振幅的差别；在采用白光照明的场合则还会由于对不同光谱吸收的不同而改变光谱成份，从而显示出不同的颜色。这种能引起光线振幅变化的物体称为振幅物体。另有一类物体，它们是*透明的，而由于不同折射率的结构组成。由于不吸收光线，不能产生明暗或色彩反差，其结构不能被普通显微镜识别，但由于物体中不同结构部分具有不同的折射率，使光线通过物体后产生一定的相位差，这类物体称为相位物体。表2比较了振幅物体与相位物体间的区别和观察方法。
表2 振幅物体与相位物体

当光线穿过一折射率为ｎ，厚度为d的物体时，光程长度为nd，其物理意义是光线穿过这一物体所需的时间。图1中a表示同一种物质，其折射率为n，但不同地方物质的厚度不一样，物体在M0处有一深度为d的微小凹口。此时通过物体其他地方与通过凹口处的光线的光程差为Δ，Δ=(n-1)d。图1中b为另一种情况，试样的厚度相同为d，但不同的地方又不同的物质组成，其折射率不同，某部分的折射率为n¢，周围部分的折射率为n，其中光程差为Δ=(n¢-n)d。但是，光程差不能被眼睛所识别，也不能在照相材料上形成反差。相差显微镜的基本原理是，把透过样品的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过样品后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4波长，如果再增加或减少1/4波长，则光程差变为1/2波长，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。
图1  相位物体 (a)厚度不同，折光指数相同；（b）厚度相同，折光指数不同。
相差显微镜（图2）将光程差变为振幅差的工作是由一个相环和相板完成的，它们可以将直接通过物体的直接光和衍射光区分开来，并进行干涉成像。环形光阑（相环） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到样品上。相板在物镜中加了涂有氟化镁的相板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4波长，从而使像的反差(对比度)大幅度增强。带有相板的物镜称为相差物镜。当光学系统性能良好时，人眼能分率的zui小反差约为0.02。
一般的相差聚光器上都装有数个环状光阑可以方便地进行转换，而相板是装在物镜中的，因此环状光阑必须与物镜匹配，即在使用时应选择与物镜上号码相同的环状光阑。
环状光阑的像必须与相板共轭面*吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜，用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环*重叠，如图3所示。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
另外，由于使用的光源为白光，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。
图3   相板和环状光阑的调节 （a）相板的暗环，(b)环状光阑未调中，(c) 环状光阑与相板成为同心圆
2.2    相差显微镜使用中的几个问题
1) 视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。
2) 晕轮和渐暗效应    在相差显微镜成像过程中，某一结构由于相位的延迟而变暗时，并不是光的损失，而是光在象平面上重新分配的结果。因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮，这是相差显微镜的缺点，它妨碍了精细结构的观察。当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。相差显微镜的另一个现象是渐暗效应或称为作用带，它是指相差观察相位延迟相同的较大区域时，该区域边缘会出现反差下降。
3) 样品厚度一般以5—10μm为宜，否则会引起其他光学现象，影响成像质量。当采用较厚的样品时，样品的上层是清楚的，深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰。
4) 载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。  当有划痕、厚薄不匀或凹凸不平时会产生亮环歪斜及相位干扰。玻片过厚或过薄时会使环状光阑亮环变大或变小。
2.4相差显微镜在高分子科学中的应用
几乎所有的高分子材料都是无色透明的，在普通显微镜中不能形成反差。由于高分子合金中不同组分折光指数不同，因此可以采用相差相微镜进行观察，其适用的折射率差值一般在0.002～0.004以上。大多数实际的共混高聚物的织态结构要更复杂些，通常也没有这样规则，可能出现各种过渡形态，或者几种形式同时存在。特别对于一个组分能结晶、或者两个组分都能结晶的共混高聚物，则其聚集态结构中又增加了晶相和非晶相的织态结构，变得更为复杂。由于当光线透过结晶聚合物试样时在晶相和非晶相之间也存在相位差，可以用相差显微镜进行观察。
仪器与试样
仪器：  XSZ-H7相差生物显微镜，真空烘箱，25ml容量瓶2个，10ml容量瓶5个，载玻片，盖玻片。
试样：  聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，甲苯。
其中一台相差显微镜配有CCD照相机，与电脑联机，可以记录合金薄膜的织态结构。
实验
制样
1) 采用溶液共混的方法制备一系列聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯的混合甲苯溶液：  
首先将12.5mg的聚苯乙烯和12.5mg聚甲基丙烯酸甲酯分别溶于25ml的甲苯溶液中得到浓度为0.5mg/ml的聚苯乙烯甲苯溶液和聚甲基丙烯酸甲酯甲苯溶液；按PS：PMMA＝1：9、PS：PMMA＝3：7、PS：PMMA＝5：5、PS：PMMA＝7：3、PS：PMMA＝9：1于10 ml容量瓶内配制聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯的混合甲苯溶液。例如：分别吸取1ml 0.5mg/ml的聚苯乙烯甲苯溶液和9ml 0.5mg/ml的聚甲基丙烯酸甲酯甲苯溶液放入10ml 的容量瓶中混合均匀。
2) 制备合金薄膜样片：
A. 用滴管吸取上述混合溶液滴几滴于干净的载玻片上，铺展开来，让甲苯溶液自然挥发*，再置于真空烘箱中干燥1小时。
B. 用滴管吸取上述混合溶液滴几滴于干净的载玻片上，铺展开来，盖上盖玻片，置于真空烘箱中于120°C退火处理2小时。
3.2 显微观察
（1）接通相差显微镜电源，把光源亮度调整到合适的强度
（2）把待观察的载玻片样品放到载物台上，选择10倍数的物镜，并选用与物镜配套的环状光阑，将物镜调到较接近于试样。
（3）取出一个目镜，插入合轴望远镜，调节望远镜聚焦螺旋使能清楚观察到物镜相板与环状形光阑的像，将环状光阑调整到与相板同心(如图3)。取下对合轴望远镜，换上显微镜目镜。
（4）聚集观察，调节显微镜载物台的上下调节钮，先粗调（眼睛从侧面看着物镜端部，注意不要让物镜碰到样品），再细调到能清晰的观察到样品。可利用工作台纵向、横向移动手轮来移动样品，观察不同区域的分相情况。
（5）观察、对比不同配比的样品在相态结构上的区别。
3.3 照相与记录
在配有CCD照相机的相差显微镜上对不同配比的合金薄膜的织态结构进行照相和记录。
数据处理
对不同PS/PMMA样品的相态结构进行描述，并指出分散相的尺寸。比较样品制备方法A和B所得样品的分相情况和相形态。
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