相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。
1、环状光栏。具有环形开孔的光栏。位于聚光器的前焦点平面上，光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦器一起组成转盘聚光器。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。
2、相板。位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。
相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%-93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。
根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效果是暗中之明。
如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿面的衍射光的相位，则被推迟了两个1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。
负相差物镜(Negative contrast)用缩写字母“N”表示，正相差物镜(Positive contrast)用缩写字母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高(High略写为H)，中(Medium略写为M)，低(Low略写为L)及低低(Low-Low略写成LL)四类，构成了负高(NH)、负中(NM)、正低(PL)和正低低(PLL)四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的相差物镜。
3、合轴调节望远镜。是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面*吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜(在镜的外壳上标有“CT”符号)，用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环*重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环*吻合。如果聚光器已升到zui高点或降到zui低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。
4、绿色滤光片。由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。
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