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大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)酶联免疫检测

试剂盒使用说明书

使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于生物素双抗体夹心技术原理，来检测大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX))，只能用于研究用途，不得用于医学诊断。

用    途： 用于大鼠血清、血浆及相关液体样本中NADPH氧化酶(NADPH-OX)的测定。

工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的水平。向预先包被了大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)单克隆抗体的酶标孔中加入NADPH氧化酶(NADPH-OX)，温育；温育后，加入生物素标记的抗NADPH-OX抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅与样品中大鼠NADPH氧化酶(NADPH-OX)的浓度呈正相关。

试剂盒组成

需要而未提供的试剂和器材

1．37℃恒温箱。

2． 标准规格酶标仪。

3． 精密移液器及一次性吸头

4． 蒸馏水，

5． 一次性试管

6． 吸水纸

注意事项

1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

3． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

4． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

5．  不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

6．  底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

操作程序

1．  标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：

2．  根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．  加样：1）空白孔：空白对照孔不加样品，生物素标记的抗NADPH-OX抗体，链霉亲和素-HRP，只加显色剂A&B和终止液，其余各步操作相同；2）标准品孔：加入标准品50μl，链霉素-HRP50μl（标准品中已事先整合好生物素抗体，故不加）；3)待测样品孔:加入样本40μl，然后各加入抗- NADPH-OX抗体10μl、链酶亲和素-HRP50μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60分钟。

4．  配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

5．  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6．  显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

7．  终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

8．  测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后10分钟以内进行。

9.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。

操作程序总结：

准备试剂，样品和标准品

加入准备好的样品和标准品，生物素标记二抗和酶标试剂，37℃反应60分钟

洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟

加入终止液

10分钟之内读OD值

计算

检测范围：10 pg/ml→300pg/ml。

规格：    48T/盒

保存：    2-8℃

有效期：  6个月（2-8℃）。