技术文章

1．细胞培养

1.1培养基的配置：

⑴ 将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温20℃～30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。

⑵ 加入2.438克碳酸氢钠。

⑶ 轻微搅拌溶解，加注射用水至1升。

⑷ 用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L盐酸溶液调pH至6.8-6.9。

⑸ 用0.2μm滤膜正压过滤除菌。

⑹ 溶液应在2℃－8℃下避光保存。

1.2 胎牛血清的处理：

没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在60℃条件下灭活30 min。在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停的摇晃，是受热均匀，防止沉淀析出来。灭活后的胎牛血清分装后放置-20℃，分装的目的是为了防止血清的反复冻融。

1. CHO的复苏

1.3.1 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.3.2 取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴锅中，不断摇动，保证1min内解冻。

1.3.3在超净台中加入37度预热的DNEN 8mL至离心管中，同时加入细胞冷冻液，800rpm离心5min。

1．3.4弃上清加入37度预热的DMEM和10%的太牛血清37度5%二氧化碳培养箱中置夜。

1.4 CHO细胞换液

（复苏后的细胞，一般是在4小时或是18小时左右对培养基进行换液）

1.4.1预热培养用液：把已经配好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.4.2 取出细胞培养板，用移液器吸出平板内的培养基，用PBS或是培养基清洗细胞，注意清洗时把清洗液缓缓延平板边缘流进，防止用力过大吹起细胞。

1.4.3 加入培养基9ml，加1ml的胎牛血清。

1.4.4 37度5%的二氧化碳培养箱中培养置夜。

1.5 CHO细胞细胞的传代

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
1) 悬浮细胞的传代
悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。 当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，800rpm离心5分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。
2) 贴壁细胞的传代
(1) 将消化液（胰酶）从冰箱中拿出，放在室温条件下预热；
(2) 吸出全部培养液，沿壁缓缓加入消化液，将培养瓶有细胞面向下，加入消化液的量至刚好可以覆盖为止约1ml，轻轻摇晃；
(3) 置于37℃消化2min左右，其间在显微镜下观察，消化至细胞收缩变圆、部分脱落即可停止消化（加入血清即可停止消化），以防消化过度；
(4) 加入两到三吸管含血清的培养液，终止消化；用吸管轻轻吹洗培养瓶有细胞的一面，以使细胞脱落干净；
(5) 细胞悬液转移至离心管内，800rpm离心5分钟；

弃上清，加入培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液（约8ml）的培养皿中，置于二氧化碳培养箱中培养。传代的盘数根据细胞的数目确定，一般在3-4盘，传代后的数目约为10⁴。

1.6 细胞计数

在操作台上取一定量经离心过混合均匀的细胞溶液（约0.5ml）放到小的灭过菌的板上，取出离开操作台后加入一定体积的0.4%的台盼蓝染色，取染色好的细胞培养液慢慢加入到细胞计数板上，要防止计数板上有空隙，然后在显微镜下数出细胞的数。（一般取对角的四个大格或中间的方格然后去平均值*10⁴）。

1.7.  细胞的冻存
细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。
1) 贴壁细胞经消化、离心收集，悬浮细胞经离心收集；
2) 大约10⁶个细胞加入1ml冻存液（细胞培养液和10%DMSO），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；
3) 加入到冻存管中。如用1.8ml的冻存管，每管不要加入超过1.5ml的细胞悬液；
4) 在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；
5) 用厚布或卫生纸包裹冻存管，置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-40℃两小时，然后置于液氮上方置夜；第二天将细胞置于液氮中；如果仅想提取细胞内的东西可以直接放在-20度的冰箱中。
6) 记下冻存管存放的位置，作好冻存记录。