上海市恒斐生物科技有限公司
2015/3/23 10:45:12声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品适用于体外定量检测血清、血浆或其
它相关生物液体中天然和重组 VD 浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！
试剂盒组成：
中文名称 英文名称 规格 保存条件
ELISA 酶标板（可拆卸） Micro ELISA Plate(Dismountable) 8×12 / 8×6 * 4℃/-20℃ #
冻干标准品 Reference Standard 2/1 支* 4℃/-20℃ #
标准品&样品稀释液 Reference Standard & Sample Diluent 1 瓶 20mL/12mL * 4℃
浓缩生物素化抗体 Concentrated Biotinylated Detection Ab 1 支 120μL/70μL * 4℃/-20℃ #
生物素化抗体稀释液 Biotinylated Detection Ab Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
浓缩 HRP 酶结合物 Concentrated HRP Conjugate 1 支 120μL/70μL * 4℃(避光)
酶结合物稀释液 HRP Conjugate Diluent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
浓缩洗涤液（25×） Concentrated Wash Buffer (25×) 1 瓶 30mL/16mL * 4℃
底物溶液（TMB） Substrate Reagent 1 瓶 10mL/6mL * 4℃(避光)
反应终止液 Stop Solution 1 瓶 10mL/6mL * 4℃
封板覆膜 Plate Sealer 5/3 张*
产品说明书 Product Description 1 份
质检报告 Certificate of Analysis 1 份
特别说明：
*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）
#: 一周内使用可存于4℃，需长时间存放或多次使用建议存于-20℃.
相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出！
检测原理:
本试剂盒采用竞争ELISA法。用VD抗原包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的VD与包被的
VD竞争生物素标记的抗VD单抗上的结合位点，游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的
亲和素，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，
TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测
OD值，VD浓度与OD450值之间呈反比，通过绘制标准曲线计算出样品中VD的浓度。
3
样品收集:
1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃隔夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集
血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可
检测。避免使用溶血，高血脂样品。
3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会
影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体
积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。
推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组
织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。zui后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，
取上清检测。
4. 细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
5. 其它生物样品：1000×g离心20分钟，取上清即可检测
具体处理方法可参考：http://www.elabscience。。ｃｎ/index.php/resources/view/aid/17671.jsp
6. 样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。
7. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻
存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融。
8. 如果您的样品中检测物浓度高于标准品zui高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议先
做预实验，以确定稀释倍数）。
试验所需自备物品:
1. 酶标仪(450nm波长滤光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 吸水纸
检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结
晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶*溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超
过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用
3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，
静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为400ng/mL）。
然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓
度：400、200、100、50、25、12.5、6.25、0ng/mL，标准品&样品稀释液直接作为空白孔
0ng/mL。如配制200ng/mL标准品：取0.5mL400ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&
样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。
4. 生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以50μL/孔计），实际配制时应多配
4
制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作
浓度。当日使用。
5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制
100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。
当日使用。
标准品稀释方法图例：（以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管）
1 2 3 4 5 6 7 8 Tube
400 200 100 50 25 12.5 6.25 0 ng/mL
洗涤方法:
1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸
去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。
操作步骤:
实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液 50μL，余孔分
别加标准品或待测样品 50μL，立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液 50μL（在使用前
15 分钟内配制），注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻
晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育 45 分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新
的标准品溶液。
2. 弃去孔内液体，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分钟，大约 350μL /每孔，甩干并在吸水纸
上轻拍将孔内液体拍干。
3. 每孔加酶结合物工作液（临用前 15 分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育 30 分钟。
4. 弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 3。
5. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶标板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分钟左右（根据实际显色情
况酌情缩短或延长，但不可超过 30 分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。
6. 每孔加终止液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的
5
加入顺序相同。
7. 立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度（OD 值）。应提前打开酶标仪电源，预热仪
器，设置好检测程序。
8. 实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至有效期结束。
注意事项：
1. 保存：试剂盒中各试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强
光中。所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染，否则可能会出现错误的结果。
2. 酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成
任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按推荐温度存放！
3. 加样：加样或加试剂时，*个孔与zui后一个孔的加样时间间隔如果太大，将会导致不同的
“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。每次的加样时间控制在
10分钟内。推荐设置复孔。
4. 温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜；洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标
板处于干燥状态；严格遵守给定的温育时间和温度。
5. 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸
水。在读数前要注意清除底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。
6. 试剂配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate体积较小，
运输过程会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用*0转/分离心1min，以使附着管壁或瓶盖的
液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。标准品、生物素化抗体工
作液、酶结合物工作液请根据所需用量配制，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请
配制标准品及工作液，尽量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab时，
一次不要小于10μL），以避免由于不准确稀释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标
准品、生物素化抗体工作液、酶结合物工作液。若需要分次使用标准品应按照每一次用量分
装，将其放在-20～-80℃贮存。避免反复冻融。
7. 显色时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已很
明显，请提前加入终止液终止反应，避免颜色过深影响酶标仪读数。
8. 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
9. 混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，使用微量振荡器(使用zui低频率)，如无微量
振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
10. 安全：试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品
时，请按国家生物试验室安全防护条例执行。
11. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）
12. 试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用，否则将影响试验结果！
结果判断:
1. 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。如有设置复孔，则应取其平均
值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，
标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，
由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程
式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
灵敏度、检测范围、特异性和重复性:
●灵敏度：zui小可测 3.75ng/mL。
●检测范围：6.25–400ng/mL。
● 特异性：可检测重组或天然的 VD，且与其它相关蛋白无交叉反应。
● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。
操作概要
1. 在各孔中加入标准品或样品各 50μL
2. 立即加入 50μL 生物素化抗体工作液，37℃孵育 45 分钟
3. 洗涤 3 次
4. 加入 100μL 酶结合物工作液， 37℃孵育 30 分钟
5. 洗涤 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分钟左右
7. 加入 50μL 终止液，立即在 450nm 波长处测量 OD 值
8. 结果计算
问题分析
若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联
系我公司为您解决问题。同时您也可以参考以下资料：
问题描述 可能原因 相应对策
标准曲线梯
度差
吸液或加液不准 检查移液器及吸头
标准品稀释不正确 溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末*溶解
洗涤不* 保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或
无色
孵育时间太短 保证充足的孵育时间
实验温度不正确 使用推荐的实验温度
试剂体积不够或漏加
检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
稀释不正确
读数数值低 酶标仪设置不正确
在酶标仪上检查波长及滤光片设置
提前打开酶标仪预热
变异系数大 加液不正确 检查加液情况
背景值高
检测抗体的工作浓度
过高
使用推荐的稀释倍数
酶标板洗涤不*
重新阅读操作手册，保证清洗*；如果用自动洗板机，
请检查所有的出口是否有堵塞
洗液有污染 配制新鲜的洗液
灵敏度低
ELISA 试剂盒保存
不当
按说明书要求保存相关试剂
读数前未终止 OD 读数前应在每孔中加入终止液
声明
1. 限于现有条件及科学技术水平，尚不能对所有原料进行全面的鉴定分析，本产品可能存在
一定的质量技术风险。
2. zui终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务
必准备充足的待测样品。
3. 只有全部使用试剂盒内的试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格
遵守 Elabscience 的实验说明才会得到*的检测结果。
4. 有效期：6 个月。
5. 本操作说明同样适用于 48T 试剂盒。
