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细胞培养常见问题解析

问：我正在养，前一段时间养了牛的，结果第二次就长细胞了，但是第二次的在第二天就发现像是染菌了，因为没舍的倒掉，换液后又放了三天，结果看见有多角形细胞生长，而且有成片生长的，当时长势还不错，但是培养瓶内漂了大片物质，当时还以为是组织碎块，但是这些东西长势飞快，换液后第二天就有很多，类似树根状的。为了防止在孵箱内感染别的细胞就倒掉了。紧接着又做了两次牛的都没有细胞生长。由于牛头难消毒，而且不方便一人操作。我又尝试养大鼠的，取新生两周后的大鼠4只，结果匀浆后，再过100目和200目网时发现200目网上没东西，请问是因为大鼠太少？还是匀浆太细了？我开始是用的布式漏斗加尼龙网过滤，但尼龙网高压后易变形，我就借来别人的不锈钢网类似勺状（底是平的），网会有影响吗？请问你养时，取200目网上的东西后能见到微血管段吗？微血管段消化离心后有含血清的培养基悬浮铺瓶后能见到细胞吗？再是您的细胞传代时是不是也要用明胶铺被培养瓶？

上海劲马答：大鼠太小了吧，取70-100g的大鼠吧，新手的话，5只大鼠做一瓶吧。没有关系的，可以看到微血管段。见不到细胞的，都是慢慢从微血管段中爬出来的。高兴的时候都铺。(养细胞还是一件比较高兴的事情吧)
实验步骤：
无菌条件下取新生小牛大脑皮层灰质部，4℃ D-Hank′s液洗涤4次，至无血迹残留。剪成1mm3左右的组织碎块并置于玻璃匀浆器内，加入两倍体积的MEM培养基，匀浆上下20次？
匀浆液先用100目（直径149μm）尼龙网布式漏斗抽滤，培养基洗涤4次，收集滤液。然后用200目（直径74μm）尼龙网布式漏斗抽滤，MEM培养基洗涤4次。细胞刮刀收集200目尼龙网上的组织（即牛脑微血管），将其置于离心管中，1500r/min离心洗涤10min。离心洗涤的脑微血管悬浮于的0.1%胶原酶中，旋涡振荡15sec以充分混匀，置于37℃恒温振荡水浴箱中振荡消化50min？
取出后旋涡振荡15sec，1500r/min离心10min，弃上清，用20%BCS的培养基悬浮，接种于明胶铺被的培养瓶中（培养瓶中加入1%明胶 - D-Hank′s液洗涤3ml，37℃孵箱中放置24h，用前倒掉明胶溶液即得明胶覆盖的培养瓶），置于细胞培养箱中，37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。静置5～7天后，可见少量细胞生长，20%BCS的MEM培养液换液，以后每2～3天换液一次，至细胞长成致密单层后可传代培养。