HiFi-MMLV一步法RT-PCR试剂盒说明书
HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit
HiFi-MMLV一步法RT-PCR试剂盒
目录号：YJ0745
保存条件：-20℃保存。
组分说明
Cat. No. YJ0745
Kit Size 100
HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix 50 μl
2×OneStep RT-PCR Buffer 1.4 ml
RNase-Free Water 1 ml
本产品仅供科研使用，请勿用于临床诊断及其他用途
产品简介
本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验研制，逆转录和PCR在同一反应体系中进行，
反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验
效率。本试剂盒包括逆转录酶、快速热启动 DNA聚合酶，同时包含适用于逆转录和
PCR扩增的反应缓冲液和实验中所必需的反应组分。HiFi-MMLV逆转录酶RNase H活性
缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解。HiFi-MMLV逆转录酶热稳定性强，可获得高产
量的cDNA。PCR反应使用的快速热启动DNA聚合酶具有扩增效率高、延伸速度快的优
良性能。*的缓冲体系使逆转录酶和聚合酶同时发挥zui大功效。使用本试剂盒扩增得
到的目的产物3′端附有一个″A″碱基，可直接用于T/A克隆。
注意事项
1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门
的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经
常更换手套。
2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃
器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的DEPC
处理后进行高压灭菌。
3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心
后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。
4．本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好
坏直接影响到RT-PCR 反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物
位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件来设计。
使用方法
1．将RNA模板、引物、 OneStep RT-PCR Buffer、OneStep RT-PCR EnzymeMix
和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2．根据以下表格配制反应体系：
试剂 25 μl反应体系 终浓度
2×One Step RT-PCR Buffer 12.5 μl 1×
Forward Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 μM 1 μl 0.4 μM
HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix 0.5 μl
RNA Template X μl 10 pg –1 μg
RNase-Free water up to 25 μl
注意：引物浓度请以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
3．涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4．将热循环仪预热到45℃，将PCR管置于热循环仪中，进行RT-PCR反应。
反应条件：
步骤 温度 时间
反转录 45℃ 30 min
PCR预变性 95℃ 2 min
变性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40个循环
延伸 72℃ 30 s
终延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般PCR实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为20-30秒，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
2）延伸时间根据扩增的片段大小设定，本产品中包含的DNA Polymerase扩增效率为1 kb/30s。
3）可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
5．反应结束后取5 μl反应产物，加入适量上样缓冲液后进行电泳检测结果。
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