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SuperRT逆转录酶(RNase H-)说明书

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2015/5/20 9:32:11

 

 

SuperRT逆转录酶(RNase H-)说明书

 

 

SuperRT Reverse Transcriptase

目录号:YJ0740

保存条件:-20℃保存。

组分说明

 

              Cat. No.                YJ0740       YJ0740A

              Kit Size                   25           100

              SuperRT,200 U/μl          25 μl       100 μl

              5×RT Buffer              120 μl       500 μl

 

本产品仅供科研使用,请勿用于临床诊断及其他用途  

 

 

产品简介

 

  SuperRT逆转录酶是一种利用大肠杆菌工程菌进行重组与表达的全新逆转录

酶。与Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLV和鸟成髓细胞病毒来源的  AMV不同,该酶

不具有RNase H活性,能够转录多种 RNA模板,可利用极低量的总RNA或mRNA

合成cDNA*链,起始样本量可低至pg级,zui大限度将RNA逆转录成cDNA*链。

SuperRT逆转录酶与RNA亲合能力强,能通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板,获

得高产量的cDNA。该酶耐热性及稳定性强,操作简单快速,可以合成   100bp-12kb的

cDNA。适用于*链cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全长cDNA文库的构建等。

 

活性定义

 

  以Poly(A)为模板,oligo(dT)为引物,在  37℃条件下,10分钟内催化掺入  1

nmol的dTTP所需酶量定义为一个活性单位(U)。

 

质量控制

 

  200 U的本酶和1  μg的16 S,23 S  rRNA在37℃下反应1小时,RNA的电泳谱带不

发生变化。

 

注意事项

 

1.在操作过程中应避免RNase污染,防止RNA降解或实验中的交叉污染,建议在专门

   的区域进行RNA操作,使用专门的仪器和耗材,操作人员带口罩和一次性手套并经

   常更换手套。

2.实验尽量使用一次性塑料器皿,若使用玻璃器皿,应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙

   酯)水溶液在37℃处理12小时,并在120℃下高压灭菌30分钟后使用,或者将玻璃

   器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用 0.1%的DEPC

   处理后进行高压灭菌。

3.本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心

   后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃,避免反复冻融。

4.若起始RNA的量小于50  ng,建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提

   供,如需要可单独向本公司订购,货号:YJ0596。

 

使用方法

 

注意:1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系,如果总RNA量大于5 μg,请按比例扩大反应体系。i逆转录操作步骤:

1.将RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上备用。

2.根据以下表格配制反应体系,总体积为20 μl。

 

试剂             20 μl反应体系             终浓度

dNTP Mix,2.5 mM Each                  4  μl         500 μM Each

Oligo-dT Primer,100 μM

或  Random Primers,50 μM               1  μl

或  Specific Primer ,10 μM

RNA Template                          X  μl          50 pg-5 μg

5×RT Buffer                           4  μl              1×

SuperRT,200 U/μl                      1  μl

 RNase-Free Water                  up to 20  μl

 

    注意:若起始RNA的量小于50 ng,则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供,如需要可单独向本公司订购,货号:YJ0596。

 

3.涡旋震荡混匀,短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。

4.42℃孵育30-50分钟,85℃孵育5分钟。反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却。

5.逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应,或置于-20℃长期保存。

 

  ii  若逆转录效率低,或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时,建议采用以下步骤:

1.将RNA模板、引物、dNTP Mix、RT Buffer、SuperRT和RNase-Free Water溶解并

   置于冰上备用。

2.根据以下表格配制反应体系,总体积为15 μl。

 

 试剂                 20 μl反应体系             终浓度

 dNTP Mix,2.5 mM Each                   4  μl         500 μM Each

 Oligo-dT Primer,100 μM

 或  Random Primers,50 μM                1  μl

 或  Specific Primer ,10 μM

 RNA Template                           X  μl          50 pg-5 μg

 RNase-Free Water                   up to 15  μl

 

 

     3.70℃孵育10分钟,迅速冰浴2分钟。

     4.短暂离心,使管壁上的溶液收集到管底。

     5.继续向以上反应液中加入以下试剂:

 

试剂                  20 μl反应体系                 终浓度

5×RT Buffer            4 μl                              

         注意:若起始RNA的量小于50 ng,则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供,

         如需要可单独向本公司订购,货号:YJ0596。

 

     6.轻轻吹打混匀,若反转录引物为Oligo-dT  Primer或Specific  Primer时,42℃孵育2分 

        钟;若反转录引物为Random Primers,则25℃孵育10分钟。

     7.加入1 μl SuperRT(200 U/μl),轻轻吸打混匀。42℃孵育50分钟。

     8.85℃孵育5分钟。反应结束后,短暂离心,置于冰上冷却。

     9.逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应,或置于-20℃长期保存。

 

     相关产品信息

 

目录号                   产品名称                                   产品特点

 YJ0580       TRIzon总RNA提取试剂            适用范围广的RNA提取试剂

 YJ0581      超纯RNA提取试剂盒

                                    兼具有适用范围广和纯度高特点的RNA提取试剂

YJ0597  超纯RNA提取试剂盒(含DnaseI)灵敏度高,可识别pg级别的模板。与RNA亲和力强,

YJ0741         SuperRT cDNA*链合成试剂盒  能够通读GC含量高,二级结构复杂的RNA模板。

YJ0744   HiFi-MMLV cDNA*链合成试剂盒         获得cDNA产物

YJ2381   SuperQuickRT  cDNA*链合成试剂盒(For Real-time PCR)     逆转录(针对于荧光定量PCR)

                               仅需15分钟,即可完成荧光定量PCR所需的cDNA 

YJ2391   SuperQuickRT MasterMix  即用型逆转录mix,只需加入RNA和水即可反应。仅

(for Real-Time PCR)                  需15分钟,即可完成荧光定量PCR所需的cDNA 

YJ0688   Es Taq DNA Polymerase            兼具高扩增效率和高保真性的PCR产品

YJ0690   Es Taq MasterMix 

 YJ0957   UltraSYBR Mixture                      荧光定量PCR—SYBR Green法

 YJ0956   UltraSYBR Mixture(With ROX)            特异性强、Ct值低、定量更准确

 

 

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