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总抗氧能力(T-AOC)测定试剂盒

卡迈舒(上海)ELISA生物技术研

2015/6/15 12:05:10

总抗氧能力(T-AOC)测定试剂盒

适用范围

   本试剂盒适用于检测动物血清、组织、植物提取等中的总抗氧化能力测定。

一、测定意义

机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切,该防御体系有酶促与非酶促两个体系,许多酶是以微量元素为活性中心,例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等,非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如:VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组胺酸、葡萄糖、铜兰蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径:(1)消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化;(2)分解过氧化物,阻断过氧化链;(3)除去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间相互起到了协同作用,以及代偿作用与依赖作用。

二、测定原理:

机体中有许多抗氧化物质,能使Fe3+还原成Fe2+,后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物,通过比色可测出其抗氧化能力的高低。

三、所需仪器设备

721或722分光光度计、水浴箱

四、试剂盒组成与配制:(100T/50样)

1.试剂一:液体60ml×2瓶,4℃保存。

2.试剂二:粉剂×2支,用时每支加双蒸水至120ml,室温保存。

3.试剂三:黄色储备液10ml×1瓶,避光冷藏保存。储备液的稀释液60ml×1瓶。

试剂三应用液的配制:临用前取储备液以稀释液稀释,比例为1:19.需多少配多少。

4试剂四:溶液24ml×1瓶,室温保存。

5.试剂五:溶液24ml×1瓶,室温保存(天冷时会凝固,每次测试前适当加温以加速溶解,直至透明方可使用)。


五、试剂盒组成与配制:(50T/25样)

1.试剂一:液体60ml×1瓶,4℃保存。

2.试剂二:粉剂×1支,用时每支加双蒸水至120ml,室温保存。

3.试剂三:黄色储备液5ml×1瓶,避光冷藏保存。储备液的稀释液30ml×1瓶。

试剂三应用液的配制:临用前取储备液以稀释液稀释,比例为1:19.需多少配多少。

4试剂四:溶液12ml×1瓶,室温保存。

5.试剂五:溶液12ml×1瓶,室温保存(天冷时会凝固,每次测试前适当加温以加速溶解,直至透明方可使用)。


六、操作

(一)   血清(浆)中抗氧化能力测定(样本前处理见附录中的*点)

1.  操作表:


对照管

测定管

试剂一ml

1.0

1.0

待测样本ml


a

试剂二ml

2.0

2.0

试剂三应用液ml

0.5

0.5

漩涡混匀器充分混匀,37℃水浴30分钟

试剂四ml

0.1

0.1

待测样本ml

a*


漩涡混匀器充分混匀,放置10分钟,蒸馏水调零,1cm光径,520nm处测各管吸光度。

*参考取样量:血清(浆)为0.1ml。

2.计算公式

总抗氧能力(单位/毫升血清)=(测定管OD值-对照管OD值)/0.01÷30×(反应液总体积ml/取样量ml)×样品测试前稀释倍数

(二)   组织中总抗氧能力的测定(样本前处理见附录中的第二点)

1.  操作表


对照管

测定管

试剂一ml

1.0

1.0

10%组织匀浆ml


a

试剂二ml

2.0

2.0

试剂三应用液ml

0.5

0.5

漩涡混匀器充分混匀,37℃水浴30分钟

试剂四ml

0.1

0.1

10%组织匀浆ml

a*


试剂五ml

0.2

0.2

漩涡混匀器充分混匀,放置10分钟,蒸馏水调零,1cm光径,520nm处测各管吸光度。

*组织匀浆参考取样量:为0.1-0.2ml。

2.计算公式

总抗氧能力(单位/毫克蛋白)=(测定管OD值-对照管OD值)/0.01÷30×(反应液总体积ml/取样量ml)×样品测试前稀释倍数÷所测样本的蛋白含量

(三)   全血中总抗氧能力的测定:(样本前处理见附录中的第五点

1.  操作步骤:


对照管

测定管

试剂一ml

1.0

1.0

待测样本ml


a

试剂二ml

2.0

2.0

试剂三应用液ml

0.5

0.5

漩涡混匀器充分混匀,37℃水浴30分钟

试剂四ml

0.1

0.1

待测样本ml

a*


漩涡混匀器充分混匀,放置10分钟,蒸馏水调零,1cm光径,520nm处测各管吸光度。

*参考取样量:全血一般用双蒸水1:9稀释取0.05ml。

2.计算公式:

总抗氧能力(单位/毫升全血)=(测定管OD值-对照管OD值)/0.01÷30×(反应液总体积ml/取样量ml)×样品测试前稀释倍数

七、简便操作(如果您的样本很多可以采用简便操作法)

1.     混合剂的配制:测试前,将试剂一、二、三每种试剂所用量乘以样本数(n)再乘以2(因每只测定管均需做对照管),然后再加上放宽的4只,即n×2+4,混合试剂的具体配制见下:

试剂名称          试剂一              试剂二           试剂三

试剂用量ml     (n×2+4)×1        (n×2+4)×2   (n×2+4)×0.5

将上面所有试剂按顺序加在一起混匀制成混合试剂。混合试剂需现用现配。

2.     血清(浆)、全血简便操作表:


对照管

测定管

待测样本ml


a

混合试剂ml

3.5

3.5

漩涡混匀器充分混匀,37℃水浴30分钟。

试剂四ml

0.1

0.1

待测样本ml

a


漩涡混匀器充分混匀,放置10分钟,双蒸水调零,1cm光径,520nm处,测各管吸光度。

3.     组织样本简便操作:

      


对照管

测定管

10%组织匀浆ml


a

混合试剂ml

3.5

3.5

漩涡混匀器充分混匀,37℃水浴30分钟

试剂四ml

0.2

0.2

10%组织匀浆ml

a


试剂五ml

0.2

0.2

漩涡混匀器充分混匀,放置10分钟,双蒸水调零,1cm光径,520nm处,测各管吸光度。

八、注意点

1.     样品保存时间:4-8℃保存5-7天,如果暂时不测,超过5天以上可将样本放在-20℃以下保存,温度越低保存时间越长。

2.     垂直加样及加试剂,不要加到管壁上。

3.     可以先加样品后加1号试剂,但混匀要充分。

4.     若为微量样品,如耳膜组织、牙髓等进行测试时,试管一定要用肥皂水煮开刷洗干净。

5.     做总抗氧化能力、总氨基酸、维生素C、维生素E的试管应与其他品种例如SOD、GSH-PX、ATPase等测试的试管分开,否则会影响酶类的活力。

6.     测定总抗氧化能力、总氨基酸、维生素C、维生素E等的试管清洗时注意:要用热水加洗涤净煮开后,剩热清洗并用自来水冲十余次,单蒸水冲一遍,烤干或晾干。否则会影响其它酶类的测试结果。

7.     在检测过程中,37℃水浴30分钟,在管子中会出现沉淀,加完试剂四后这沉淀会消失,并且不会影响检测结果。

8.     在混匀时,用漩涡混匀器,使液体上下充分混匀(一定使zui下面液体也能旋转到上面)。

9.     试剂四难吸难打,注意:在吸取试剂四及加试剂四时要慢慢吸打。

10.  本试剂盒仅用于科研。

T-AOC测定附录

样本前处理

1.     血浆样本前处理:

血浆在测试前3500转/分离心10分钟,取上清待测,否则有 些抗凝剂会引起沉淀及混浊,肝素抗凝的血浆不要离心,血清不需要离心。

2.     组织样本的前处理:

组织匀浆的制备:准确称取组织重量,按重量体积比加9倍生理盐水制成10%的匀浆,2000-2500转/分离心10分钟,取上清待测。同时用双缩脲试剂测定10%组织匀浆蛋白。

3.     培养细胞的前处理:

培养细胞悬液的制备:

将培养细胞消化,离心,弃上清,留下层细胞,用生理盐水或匀浆介质制备成107/cm3的悬液,即107/ml的悬液,再进行破碎。破碎细胞的方法有三种;1.用云将器匀浆。(可以用匀浆机,也可以用玻璃匀浆器手工匀浆)。2.用进口的超声粉碎器粉碎。3.反复冻融3次。(第3种方法有时会影响酶活力。)制备号的细胞悬液不需要离心,在测试家样前要摇匀后取样。同时用考马斯亮兰试剂测定组织蛋白。

4.     培养细胞的上清及部分体液均可以按照血清样本处理,一般直接加样。

5.     全血样本前处理,一般用双蒸水10倍稀释,具体稀释倍数及取样量要做预试。




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