说明 |
| Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(MMLV RT，M-MLV 逆转录酶) 是一种RNA 依赖的DNA 聚合酶，可用于长mRNA (>5kb) 为模板的cDNA 合成。该酶是M-MLV 的pol 基因产物，由一个分子量为71kDa 的亚单位组成。M-MLV RT 的RNase H 活性比常用的鸟类成髓细胞性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV) 逆转录酶弱。
| 特点 |
| ? 提供5× 反应缓冲液：250mM Tris-HCl (pH 8.3，25℃ )，375mM KCl，15mM MgCl2，50mM DTT。
? 高温失活：在70℃加热M-MLV RT 10 分钟灭活。
| | 储存条件 |
| 储存于-20℃。 |
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产品目录号： M1701 M1705
M-MLV 反转录酶简明操作步骤
cDNA*链合成操作步骤：
请使用者准备：
z 重组 RNasin?核酸酶抑制剂 (目录号 N2511)
z dATP,10mM
z dCTP,10mM
z dGTP, 10mM
z dTTP, 10mM
z 无核酸酶的水
1． 在一支无核酸酶污染的小离心管中加入： RNA 2ug 引物 1ug 无核酸酶水补齐 15ul 加热离心管到 70℃，5 分钟，这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却，以避免重新形成二级结构。短暂离心，使溶液归于管底。
2. 按以下顺序在复性的引物/模板管(即以上小离心管)
中加入下列组分：
注意：不要改变引物与 mRNA的比例。
M-MLV 5XReaction Buffer 5ul
dATP,10mM 1.25ul
dCTP,10mM 1.25ul
dGTP, 10mM 1.25ul
dTTP, 10mM 1.25ul
重组 RNasin?核酸酶抑制剂 25units M-MLV 反转录酶 200units 加无核酸酶水补齐 25ul
3. 轻弹离心管混合溶液。若使用随机引物，在 37℃孵育 60分钟进行反转录反应；若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特异引物)，则在 42℃孵育 60分钟进行反应。
4. 第二条链合成可使用您选择的操作方法，也可参考:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64.
注意：M-MLV 反转录酶缓存液与许多下游应用相容。在进行第二链合成或 PCR 之前，一般无需使用酚抽提及乙醇沉淀纯化合成的*链 cDNA。
