上海雅吉生物科技有限公司
2015/6/23 14:31:28实验方法原理
碱裂解法是一种应用的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会*分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
实验材料 菌液
试剂、试剂盒 质粒抽提试剂盒RNase ABuffer S1Buffer S2Buffer S3Buffer W1Buffer W2 concentrateEluent
仪器、耗材 DNA 制备管 离心管移液枪枪头枪头盒离心机
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
耗材：DNA 制备管，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。
RNase A：50 mg/ml，室温保存。
Buffer S1：细菌悬浮液。加入RNase A 后，4°C 贮存。
Buffer S2： 细菌裂解液，室温密闭贮存。(若出现沉淀，应于37°C 温浴溶解并冷却至室温后再使用。）
Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
二、实验准备
1. *次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4°C贮存。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
3. *次使用前，Buffer W2 concentrate中加入体积的无水乙醇。
三、操作步骤
1. 取1-4 ml 在LB 培养基中培养的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），12 000×g 离心1 min，弃尽上清。
2. 用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
3. 加入250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合4-6 次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。
4. 加入350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8 次，12 000×g 离心10 min。
步骤5～7 可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。
A. 负压法
. 将质粒DNA 制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4 中的离心上清并转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。
6A. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。
7A. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。
B. 离心法
5B. 吸取步骤4 中的离心上清并转移到DNA 制备管（置于2 ml 离心管中），12 000×g 离心1 min。
6B. 将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12 000×g 离心1 min，弃滤液。
7B. 将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12 000×g 离心1 min， 弃滤液；以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。
8. 将制备管置回2 ml 离心管中，12 000×g 离心1 min。
9. 将制备管移入新的1.5 ml 离心管中，在DNA 制备膜正*加60-80 μl 水或Eluent，室温静置1 min。12 000×g 离心1 min。
注意事项
1. Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 本试剂盒为AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒，适合于从1-4 ml 细菌培养物中提取多至20 μg 高纯的质粒DNA。
