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今日技术解析-RNA点杂交实验

卡迈舒(上海)ELISA生物技术研

2015/7/7 13:37:36

实验步骤


纯化的RNA的点杂交和狭线杂交:

1. 安装印迹装置

   1) 切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿,在20×SSC中室温泡1 h。

   2) 在膜浸泡期间,先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印迹装置,再用无菌水洗干净。

   3) 把两片厚滤纸用20×SSC浸湿,再放到真空器顶部。

   4) 把样品槽插入装置的上部,把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部,用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

   5) 加紧夹板,连接真空管。

   6) 加入10×SSC直至液面没过尼龙膜,关掉真空,再用10×SSC充满。

2. RNA样品准备

   1) 把每个RNA样品(溶解在10μl水)分别与30μl RNA变性液混合。

   2) 65℃温育5 min,然后在冰上冷却。

   3) 向每个样品中加入等体积20×SSC。

   4) 轻轻向印迹装置中吸入10×SSC,直到淹没尼龙膜。

3. RNA样品的印迹和RNA在膜上的固定

   1) 把所有样品轻轻加入狭线中,然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后,每个狭线用1 ml 10×SSC洗两次。

   2) 当第二次洗膜完成后,继续轻轻吸干膜。

   3) 取下膜,用紫外交联、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。

4. 固定化RNA的杂交与洗膜

   1) 把膜放入烤盘或杂交炉中,加入10~20 ml预杂交液68℃温育2 h。

   2) 把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育12~16 h。

   3) 杂交完后从塑料袋中取出膜,然后尽可能快地把膜转移到室温下装有100~200 ml、1×SSC(0.1% SDS)的塑料容器中。盖紧塑料容器,放到摇床上轻摇10 min。

   4) 把膜转移到另一个装有100~200 ml、预热到68℃的0.5×SSC(含0.1% SDS)的塑料袋中,然后在此温度下轻摇10 min。

   5)重复洗膜两次,使总的洗膜次数达到三次。

   6) 用滤纸吸干膜,在-70℃条件下放射自显影24~48 h(Kodak XAR-5 或相当的胶片)。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然,磷光成像仪也可以用来成像。


RNA斑点印迹的制备:

1.裁一张大小合适的滤膜,用软铅笔标记RNA加样的位置,一个cm的方格即可。

2.以20×SSC浸泡滤膜。

3.在65℃用以下溶液温育5min,使10~20μg的总RNA变性。


总RNA(10~20μg)

2.0μl

变性液

6.0μl


置冰浴快速冷却5min,用微量离心管离心片刻以回收液滴,将管置于冰浴。

4.将滤膜铺在一叠经20×SSC浸泡过的滤纸(如Whatman 3MM)上。

5.在膜上点样,每孔4μl RNA,待一孔干燥后再加另一孔。

6.将滤膜置滤纸(3MM)上稍微晾干,用20×SSC漂洗片刻。

7.当滤膜仍潮湿时,将滤膜RNA面朝下在紫外线透照仪照射3~5min,使RNA固定于滤膜上,此滤膜已可用于杂交。

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