抗DIG碱性磷酸酶直接检测标记效果

RNA转录物能通过琼脂糖变性胶电泳检测其探针完整性。标记效果可通过抗DIG碱性磷酸酶直接检测，有两种方法可以选择。
 
方法一、用标准DIG测试条比较鉴定
 
使用测试条鉴定包括两个步骤：首先，将转录标记的RNA稀释成一系列的浓度，并点样到空白测试条上（对照测试条已用一系列浓度点样）；其次，将点样的备测试条与对照测试条一起进行免疫、显色反应，然后根据对照测试条计算备测样品的浓度。
 
1.  将转录反应物稀释成浓度约为1 μg/ml，即取前述转录标记物1 μl 加入99 μl RNA稀释缓冲液，如果转录标记反应正常其浓度应大约为1 μg/ml。
2.  取5支Eppendorf管，按A、B、C、D、E顺序编号，将1 μg/ml 浓度的RNA标记物按下列方式稀释成一系列浓度：
 
编号    RNA标记物稀释方法    RNA终浓度
A    1 μg/mlRNA 10 μl＋RNA稀释缓冲液23 μl    300 pg/μl
B    1 μg/mlRNA 5 μl + RNA稀释缓冲液45 μl    100 pg/μl
C    A 5 μl + RNA稀释缓冲液45 μl    30 pg/μl
D    B 5 μl + RNA稀释缓冲液45 μl    10 pg/μl
E    C5 μl + RNA稀释缓冲液45 μl    3 pg/μl
 
3.  将空白测试条置于一聚酯膜上，以每一浓度1 μl 的量在测试条上点样，在聚酯膜上做好点样浓度标记，切勿直接在测试条上做任何记号，切勿用手接触测试条。
4.  室温干燥约2 min，同时制备测试溶液。
5.  在2ml封闭液中加入1 μl Anti-DIG-AP。
6.  显色底物溶液：在2 m l检测缓冲液中加入9 μl NBT溶液和7 μl BCIP溶液。
7.  准备5个样品池（2.5 ~ 5 ml 容量），1~6顺序编号，依次加入2 ml 以下溶液。
（1）封闭液；
（2）抗体溶液（第5项）；
（3）③④⑤洗膜缓冲液；
（4）检测缓冲液；
（5）显色底物溶液（第6项）。
8．将样品测试条和对照测试条按下列顺序在上述准备的溶液中浸渍处理，两步骤直接让多余的溶液滴在吸水纸上。
（1）封闭， 2 min。
（2）抗体结合， 3 min。
（3）封闭，1 min。
（4）洗膜，1 min。
（5）平衡，1 min。
（6）显色反应（黑暗），5~30 min。
9．显色反应30 min，即停止反应（延长显色反应时间，会增加背景而影响结果比较），用水漂洗测试条，将其置于3 MM Whatman滤纸上空气干燥，然后在光下检测。
 
结果评估
显色反应进行5~10 min时，对照测试条中300 pg 浓度的样点即会出现颜色，30 min时3 pg 的样点也可见颜色，随即停止颜色反应。漂洗后比较对照与待测样品颜色，根据对照浓度与待测样品的稀释浓度计算标记物的数量。如果标记物浓度低于10~30 pg 则不适宜采用这一快速检测方法。
 
方法二、用DIG标记的RNA对照比较检测
 
1.  将DIG标记的对照RNA先稀释成20 ng/μl（5 μl 对照RNA加入20 μl DEPC-H2O），取5支Eppendorf管以A、B、C、D、E、F顺序编号，将对照按下列比例稀释成一系列浓度：
 
编号    对照RNA稀释方法     终浓度
A    20 ng/μl RNA 2 μl＋RNA稀释缓冲液38 μl    1 ng/μl
B    A 5 μl＋RNA稀释缓冲液45 μl    100 pg/μl
C    B 5 μl＋RNA稀释缓冲液45 μl     10 pg/μl
D    C 5 μl＋RNA稀释缓冲液45 μl     1 pg/μl
E    D 5 μl＋RNA稀释缓冲液45 μl     0.1 pg/μl
F    E 5 μl＋RNA稀释缓冲液45 μl    0.01 pg/μl
2.  按照同样的方法将待测的DIG－RNA也稀释成一系列浓度，编号用1、2、3、4、5、6以便于与对照区别。
3.  取一片尼龙膜，按照前述方法一的方法点样，*排点对照，第二排点待测样，不必从浓度A开始，只需点C~F浓度进行检测。
4.  用UV交联方法或尼龙膜也可采用120℃烘膜30 min 的方法使RNA固定于膜上，再用洗膜缓冲液洗膜几秒种。
5.  将膜置于封闭液中，室温下封闭30 min。
6.  准备抗体溶液：用封闭液按1∶5000的比例稀释Anti-DIG-AP。
7.  将膜置于抗体溶液中，室温下保持30 min，注意抗体溶液必须没过膜。
8.  室温下用洗膜缓冲液洗膜2次，每次15 min。
9.  再将膜置于检测缓冲液中2 min。
10.  在10 ml 检测缓冲液中加入45 μl NBT和35 μl BCIP配制成显色底物溶液（现配现用）。
11.  除去检测缓冲液，加入显色底物溶液，在黑暗下显色大约16小时（一般几分钟即可见开始显色），注意在显色过程中，切勿振荡样品盘。
12.  当颜色沉淀充分后，停止显色反应，用TE缓冲液或无菌水洗膜5 min。
13.  比较对照和样品的颜色测算浓度。