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2015/7/23 9:19:50细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞冻存在-196℃液氮中,储存时间几乎是无限的。细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融。
1. 冻存细胞
(1)选对数增生期细胞,在冻存前1d换液。
(2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×10 7 /ml左右密度,离心,去上清。
(3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
(4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m悬液。
(5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,做好标记。
(6)冻存:在特殊的 仪器 或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min时间内,下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。
操作时应戴防护眼镜和手套,以免液氮冻伤。