乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒的试剂组成以及操作列表

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乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒

测定意义：

LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD⁺/NADH之间互变。

测定原理：

LDH催化NAD⁺氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：30mL×1瓶， 4℃保存；

试剂一：液体15 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入1.3 mL双蒸水充分溶解备用，配好后-20 ℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；

试剂三：液体15 mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体50 mL×1瓶L，4℃保存；

样品测定的准备：

1、 细菌、细胞或组织样品的制备 ：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液或者生理盐水进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作表（在1mL EP管中反应）：

充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min

充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴15min

充分混匀，室温静置3分钟，450 nm下测定吸光度

注意事项：

1、粗酶液的提取必须在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。测定过程中样本﹑试剂二和标准应用液必须在冰上放置。

3、由于每个样本都要做测定管和对照管，因此本试剂盒50管可测24个样本。

LDH活力单位的计算：

1、血清（浆）LDH活力的计算

单位的定义：每升血清（浆）与基质作用15分钟，在反应体系中生成1 μmol的丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/L）=1379×（A测定管-A对照管）

2、组织中LDH活力的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白与基质作用15分钟，在反应体系中生成1 nmol的丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/mg prot）=1379×（A测定管-A对照管）÷蛋白浓度（mg/mL）

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织与基质作用15分钟，在反应体系中生成1 nmol的丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/g 鲜重）=1379×（A测定管-A对照管）÷样本鲜重（g/mL）

3、细菌或细胞中LDH活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白与基质作用15分钟，在反应体系中生成1 nmol的丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/mg prot）=1379×（A测定管-A对照管）÷蛋白浓度（mg/mL）

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞与基质作用15分钟，在反应体系中生成1 nmol的丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH（U/10⁴ cell）=1379×（A测定管-A对照管）÷细菌或细胞密度（10⁴ cell /mL）