单向定量免疫电泳实验

实验方法原理    火箭电泳(rocketimmunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电泳，将抗原样品放在含有专一性抗体的凝胶孔中，抗体静电荷为零不移动；而抗原分子在电场作用下移动，形成抗原-抗体复合物沉淀下来。后面的抗原继续向正极泳动遇到沉淀的抗原-抗体复合物，抗原过量使复合物沉淀溶解，与未结合的抗体结合，又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来，不断沉淀-溶解-再沉淀，zui后形成锥形的沉淀峰，称火箭电泳。其高度与所加抗原的量大致成比例。
（来源：生物化学与分子生物学实验指导，邵雪玲等，武汉大学出版社，2003）
实验材料    人IgG 兔抗人IgG
试剂、试剂盒    琼脂
仪器、耗材    玻璃板 电泳仪 水平电泳槽 打孔器 微量加样器 恒温水浴锅
实验步骤    
1. 抗体琼脂板的制备
 
将融化的琼脂冷却到55 ℃，加入适量（看免疫血清的效价高低而定）的抗体，立即混匀（不要出现泡沫），将上述的抗体琼脂（大约20 ml）制成琼脂板，冷却后按下图打孔备用。

 
2. 加样
 
在各孔里加入按二倍连续稀释法稀释的抗原。
 
3. 电泳
 
通电后调电压为10 V/cm，或电流强度为2～4 mA/cm，时间约1～5小时。
 
4. 观察
 
在电场作用下，定量的抗原在含有定量的琼脂中泳动后，比例合适时，可在短时间内出现锥形沉淀，此沉淀线形似火箭，抗原浓度越高，“火箭”面积愈大。但抗体效价要高。
 
5. 定量抗原

在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后，测定沉淀峰的高度，用圆规仔细测量沉淀峰zui与样品孔中心间的距离，记录结果。以标准样品即不同抗原浓度为横坐标，以沉淀峰的高度为纵坐标绘制标准曲线。根据量得的待测抗原沉淀峰的长度，从标准曲线查出相应抗体含量，在乘以样品稀释倍数即可计算出该抗原的含量。
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注意事项    
如果计算，可用求积仪测定峰的面积。影响单向定量免电泳的因素很多，主要是要选择好抗体浓度，使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量，如效价高，则免疫血清琼脂的比例为1∶5～9，如效价低；;则免疫血清与琼脂的比例为2∶5。另外，抗原含量也要注意，过高过低都影响火箭峰形。如抗原含量过低，则峰形太矮，如抗原浓度过高，则火箭峰不封口。如抗原抗体量合适，泳动的距离大约为2～5 cm。