单克隆抗体的腹水制备实验

实验材料    杂交瘤细胞
试剂、试剂盒    *DMEM-10HEPES丙酮酸钠PBS
仪器、耗材    注射针头离心管转子离心机
实验步骤    
1.  用20G或22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠0.5 ~ 1 ml，1周后接种细胞。
 
2.  在175 cm2培养瓶中加*DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。
 
3.  将培养液转入50 ml 锥形离心管中，室温下500 g 离心5 min。
 
4.  细胞重悬于50 ml 无菌的PBS或HBSS（不含FBS）中洗涤。然后室温下500 g 离心5 min，弃上清。重复2次，然后细胞重悬于5 ml 的PBS或HBSS中。
 
5.   计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。
 
6.  用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5×102细胞/ml。
 
7.  用一个10 ml 的无菌的带22G针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射2 ml 细胞，等待腹水形成（1~2周）。
 
8.  收获腹水。

（1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。

（2）另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔1~2 cm 深。

（3）进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管。

（4）令腹水滴入一只无菌的15 ml 聚丙烯锥形离心管中。
 
9.  于室温下，1 500 g 离心腹水10 min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成（在1周内）。
 
10.  再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水（2~3天），具体操作同步骤8，腹水的加工处理操作同步骤9。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。此时，可处死小鼠

11.  把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于56℃水浴45 min 进行热处理，如果凝块形成，可参照步骤9中方法去除之，然后再离心。

12.  采用适当的方法检测腹水中的MAb的滴度。
 
13.  按大于1：10的比例稀释MAb，并进行滤过除菌，滤膜孔径为0.45 μm，分装并冻存于-70℃，避免反复冻融，可冻存数年之久。