细胞冻存的具体操作步骤

   细胞一般在冻存及复苏的时候，很多客户因为操作不当，比如温度、保护剂、时间等没控制好，导致冻存及复苏细胞的时候，细胞容易出现活性差、状态不好等情况，其实细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”，这样可以zui大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性；缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的物理损伤。复苏细胞采用快速融化的方法可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

这次浅谈一下细胞冻存的具体操作步骤及要点：

细胞冻存操作要点：

1、细胞冻存前12~24h，换新鲜培养基，使细胞一直处于对数生长期。

2、待细胞长至80%汇合时胰酶消化，用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液，1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。

3、弃上清，加入冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×10⁶~1×10⁷cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内，每管1~1.5mL，拧紧盖子。在管壁上做好标记，标明细胞名称、冻存日期等。（细胞冻存液配方可为胎牛血清：培养基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培养基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根据各实验室实际条件调整）

4、按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一个晚上→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃放一个晚上，再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于zui低刻度线；冻存5次后异丙醇需要跟换一次，以免影响冻存效果。

5、细胞冻存后应取出一管复苏，技术细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。