人支气管上皮样细胞，BEAS-2B细胞

人支气管上皮样细胞，BEAS-2B细胞  cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。

从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以*条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。

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Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制备
1．用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部，用无菌剪刀剪去露在吸管外的棉花并弃去，再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2．将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连，将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl的TE（pH7.6）溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸，直至吸管内充满缓冲液，用止血钳关闭软管。
人乳腺导管瘤细胞，BT-474细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
人乳腺癌细胞，HCC1937细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
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人乳腺癌细胞，ZR-75-30细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
人乳腺癌细胞，MCF7细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
人乳腺癌细胞，BC009细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
人乳腺癌细胞，BC－020细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
3．在吸管宽端接一段乙烯泡沫管，让糊状物静置数分钟，放开止血钳，当缓冲液从吸管滴落时，层析柱亦随之形成。如有必要，可加入更多的Sepharose CL-4B，直至填充基质几乎充满吸管为止。
4．将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后，关闭柱子底部的软管。
 
依据大小分离回收DNA
5．用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体，将cDNA加到柱上（体积50μl或更小），放开止血钳，使cDNA进入凝胶。用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微量离心管，将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
6．用手提式小型探测器监测cDNA流经柱子的进程。放射性cDNA流到柱长2/3时，开始用微量离心管收集，每管2滴，直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7．用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。
8．从每一管中取出一小份，以末端标记的已知大小（0.2kb~5kb）的DNA片断作标准参照物，通过1%琼脂凝胶电泳进行分析，将各管余下部分贮存于-20℃，直至获得琼脂糖凝胶电泳的放射自显影片。
人乳腺癌细胞，BC－021细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
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人包皮成纤维细胞，HFF细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
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人羊膜细胞，HA细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
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人卵巢癌细胞，Caov-3细胞 （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
9．电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上，盖上一张Saran包装膜，并在凝胶干燥器上干燥。干燥过程前20min至30min于50℃加热凝胶，然后停止加热，在真空状态继续干燥1~2h.
10．  置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。
11．  在cDNA长度≥500bp的收集管中，加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀，用微量离心机于4℃以12 000g离心15min，以回收沉淀的cDNA。
12．  将DNA溶于总体积为20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。
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13．  测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于λ噬菌体臂相连接的DNA总量。
[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到第二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNA第二链合成量=可用于连接的cDNA

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