体外受精失败后行卵胞浆内单精子注射补救的临床分析

    目的 探讨对常规体外受精(IVF)周期受精*失败患者，于受精后18～20 h行补救卵胞浆内单精子注射 (ICSI)的临床价值。方法 2004年1月至2009年12月我院生殖中心常规IVF受精*失败周期44例，于受精后18～20 h行补救ICSI。解冻复苏补救ICSI受精卵的胚胎，共移植2个周期。

    结果 在44例常规IVF*未受精周期中，获卵374个，补救ICSI 的MII卵201个，正常受精的MII卵127个，获48个胚胎，7例临床妊娠，健康新生儿7名，1例单胎妊娠继续妊娠中，胎儿情况良好。解冻复苏补救ICSI受精卵2周期，结果1例妊娠，单胎，于孕早期流产。ELISA试剂盒

    结论 对常规IVF受精*失败周期，于受精后18～20 h行补救ICSI可作为常规IVF受精失败的有效补救措施。

【关键词】  体外受精;受精失败;卵胞浆内单精子注射;妊娠率

    常规体外受精胚胎移植周期中，由于卵母细胞和精子内在的结构和功能缺陷、精卵结合障碍、卵膜融合等过程存在问题，常有一些周期存在受精*失败的情况，具体原因在每一个受精失败周期中是不同的。近年来有报道在常规体外受精(IVF)失败后行卵胞浆内单精子注射(ICSI) 补救，有获得可移植胚胎可能，可以获得妊娠，可减少取消周期比例。为了避免取消此次常规IVF治疗周期，争取为患者获得一次受孕的机会，我中心采取了对常规IVF中*受精失败的卵母细胞，在受精后18～20 h实施ICSI补救，对常规IVF*受精失败进行弥补。

    本文回顾性分析我院生殖中心2004年1月至2009年12月对常规IVF周期受精*失败的44个周期, 于受精后18～20h行补救ICSI，作为一种常规的治疗选择，获得临床妊娠，取得良好效果，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 资料来源

    于2004年1月至2009年12月在我中心实施IVFET治疗的周期中，选择44个*受精失败的常规IVF治疗周期，于受精后18～20 h将未受精的卵实施补救ICSI。其中常规受精*失败后行补救ICSI共44个周期，其新鲜胚胎移植周期共31个，解冻补救ICSI受精卵胚胎，共移植2个周期。不孕病因包括双侧输卵管阻塞29例，子宫内膜异位症7例，男方少弱精子症8例。

1.2 方法

    1.2.1 超排卵方案 采用控制性超排卵(COH)方法，常规长方案或短方案[1]，使用药物为达菲林(Diphereline,益普生,天津)，注射用重组人促卵泡激素(GonalF,雪兰诺,瑞士)，注射用尿促卵泡激素(丽申宝，丽珠集团)注射用尿促性素(乐宝得，丽珠集团)，注射用绒促性素(HCG，丽珠集团)或(Profasi 雪兰诺,瑞士)。

    1.2.2 取卵 卵泡充分生长发育至成熟(超声实时显像见双卵巢内有1个以上卵泡直径> 18 mm或2个以上卵泡直径17 mm) 时，当天晚上注射HCG 10 000 IU或Profasi 250 μg,注射后的36～37 h，行经阴道B 超引导下取卵术回收卵母细胞。

     1.2.3 卵母细胞的处理 于常规IVF精卵相遇后16～18 h，机械法去除颗粒细胞，在倒置显微镜(×400)下观察受精情况。对受精*失败患者经患者同意后，立即使用取卵当日处理好的精子对MII期卵母细胞行补救ICSI。

     1.2.4 精液处理 采用密度梯度离心法制备精子，调整精子密度为(5～8)×105/mL。

     1.2.5 补救ICSI后观察 补救ICSI后18～20 h观察受精情况，选取含双原核及第二极体的正常受精卵继续培养24 h，选择胚胎(补救ICSI后48h观察受精卵分裂的情况，卵裂速度正常、卵裂球大小均一或大致均一、卵裂球数目均等或大致均等、碎片≤20% 、胞浆饱满、质地均匀或大致均匀的胚胎定为胚胎。)2～3个进行宫腔内移植。ELISA试剂盒

     1.2.6 临床妊娠证实 患者于取卵后开始黄体功能支持，于胚胎移植后14～16 d留晨尿测尿HCG，阳性者移植后4周行B超检查，B超见妊娠囊和胚胎原始胎心搏动者诊断为临床妊娠。

2 结果

     常规IVF治疗周期*受精失败44个周期，共获卵374个，可注射补救ICSI 的MII卵201个，正常受精的MII卵127个，受精率63.18%，83个正常受精的胚胎发生分裂，卵裂率65.35%，48个胚胎，胚胎率为57.83%，31个新鲜移植周期中共有7例临床妊娠(见表1)，妊娠率22.58%，包括4例单胎妊娠和3例双胎妊娠，1例孕早期流产，其中1例双胎妊娠于妊娠中期自然减一胎，健康新生儿7名。1例单胎妊娠继续妊娠中，胎儿情况良好。解冻补救ICSI受精卵胚胎，共移植2个周期中妊娠1例，系单胎，于孕早期流产　表1 7例妊娠患者基本情况

3 讨论

    目前有报道称IVF 周期中受精*失败的发生率约10%～20%[2]。常规IVF失败的原因可能来源于卵母细胞也可能来源于精子，zui终导致卵子受精*失败的原因是精卵不能识别或识别失败，精子因素有精子顶体功能缺陷，精子诱发顶体反应功能障碍，造成精子难以穿透卵子的透明带、精卵融合障碍;精子受体外处理时精子密度、活动力、精子形态异常等，使精子不能顺利进人卵细胞，导致受精失败。     卵子因素有卵母细胞的透明带增厚、坚硬;卵子胞浆线粒体数量减少以及功能障碍;超排卵方案后体内激素水平改变使卵母细胞胞质与细胞核的成熟不同步及取卵时间不合适，卵母细胞不成熟，精卵原核形成不同步，都可能影响卵母细胞的正常受精过程;卵母细胞透明带上缺乏相应的精子结合受体，造成精卵结合障碍，导致不能受精;卵子缺乏卵母细胞结合蛋白，至精子不能顺利进入卵母细胞。

    补救ICSI 的受精率与卵母细胞的卵龄有着直接的关系[3]。卵母细胞长时间暴露于培养液内，毒性物质接触时间增加导致卵母细胞内遗传物质发生异常的概率会增加，染色体异常的几率也增加[4]。本研究44个补救ICSI周期受精率为63.18%，可能与补救ICSI时间较早有关，大约取卵后18～20h。我们的经验是于常规IVF精卵相遇后16～18 h，机械法去除颗粒细胞，在倒置显微镜(×400)下观察受精情况。若发现*受精失败，立即放下所有工作，经患者同意后，立即使用取卵当日处理好的精子对MII期卵母细胞行补救ICSI。

    如何预防和避免常规IVF周期受精失败，目前还没有一个非常有效的方法。有学者因为补救ICSI后妊娠率低而并不推荐ICSI作为常规体外受精失败后的补救措施[5]。虽然已有补救性ICSI的胚胎获得健康后代的报道[6]，但补救性ICSI 后的受精率、胚胎率和妊娠率均显著低，临床上常规应用的意义不大[7-8]。

    本研究44个补救ICSI周期行补救性ICSI受精率63.18%，卵裂率65.35%，胚胎率为57.83%，妊娠率19.44%，我们认为补救性ICSI的治疗方案有获得可移植胚胎可能，可以获得妊娠，可减少取消周期比例，对于补救性ICSI的临床应用价值评价，应结合患者卵泡数，可供行补救ICSI 的卵母细胞数，卵母细胞的成熟度，在此基础上得到患者同意后选择恰当的时机行补救ICSI，有获得妊娠和分娩可能，而对于卵母细胞数目较少的受精*失败的周期来说，该方案的可行性值得考虑。

    本文分析发现常规IVF治疗周期*受精失败44个周期中，31个新鲜移植周期中共有7例临床妊娠，包括4例单胎和3例双胎。1例孕早期流产，6例已足月产，1例顺产，5例剖宫产，健康婴儿7名，1例继续妊娠中，胎儿情况良好，2个解冻补救ICSI受精卵胚胎周期中妊娠1例，于孕早期流产。

    说明补救ICSI可在一定的程度上增加患者受孕的可能性，尤其在患者体外受精*失败无胚胎可移植的情况下，这种补救ICSI措施可作为一种挽救方案，其无论对患者说对医生都是非常有价值的。若补救ICSI后未获得妊娠，也可在补救ICSI后观察患者的受精和卵裂情况，为患者下一周期的治疗方案提供有效的参考价值。因此，补救ICSI不失为一种挽救IVF受精失败周期的有效方法。ELISA试剂盒