分光光度计

分光光度计的结构与使用方法

1. 分光光度法定义、特点与应用
   1.1 定义: 分光光度法是利用物质所*的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术.
   1.2 特点: 灵敏,,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质.
   1.3 应用: 生物、化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.
2. 分光光度计的分类

红外分光光度计: 测定波长范围为大于760 nm的红外光区
可见光: 测定波长范围为400~760 nm的可见光区
紫外: 测定波长范围为200～400 nm的紫外光区

1. 工作原理

人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)
它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率zui小的无线电波到频率zui大的γ-射线排成一列,即组成电 磁波的波谱.
2.2.1 的光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其*的 发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由 红,橙,黄,绿,蓝, 靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光的光源.
氢灯的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源.
2.2.2 物质的吸收光谱(1)
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线, 即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
2.2.2 物质的吸收光谱(2)
当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成 此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液.
入射光 = 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光
如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则:
入射光 = 吸收光 十 透过光
2.2.3 物质吸光度(A)与透射比(T)的关系
设 I0 为经过空白校正后入射光的强度;I 为透过光的强度.
根据实验得知 I = I0 ?10-εc l
式中,c 表示吸收物质的摩尔浓度;l 表示吸收物质的光径,用cm表示;ε表示吸收物质的摩尔消光系数,它表示物 质对光的吸收特性,不同物质的ε数值不同. 所以 I / I0 = 10-εc l
令 T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl
若以T对吸收物质的浓度作图,则得图1-5-2中的曲线.
由上式可得 1g(1 / T) = εc l
lg(l / T)为物质的吸光度(A) A = 1g(1 / T)
2.2.4 Lambert -Beer定律( E = εc l)
上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.

1. 的基本结构
   无论哪一类都包括 :光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表5个基本部件

4.1 的基本部件(1):

光 源: 上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光 源;在紫外光区多使用氢弧灯.
单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在中多用作为色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350 nm的紫外光区 工作时,必须采用石英池或熔凝石英池.  
4.2 的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应*相同,以免产生误差.比色皿上的指纹, 油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必*清洗.
常用光电池,光电管和光电倍增管三种.
测量装置 —般常用的紫外光和可见光有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的 仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线.
4.3 检测器
棱镜与光栅
棱 镜: 光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同;因而能将不同波长的光分开.玻璃对紫外线的吸收力强,故玻 璃棱镜多用于可见光.石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光中广为应用.
衍射光栅: 在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15 000—30 000条).由于刻线处不透光,通过光的 干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱.
光源照到棱镜(或光栅)以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.透过棱镜的光 再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图.如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就 可以从出射狭缝射出所需要的单色光.整个装置称为"单色器"
1) 检测器---光电池
光电池装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.*层是一种导电性良好的金属,这是光 电池的负极.中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁,这 是光电池的正极.当光电池受光照射以后,半导体硒的表 面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路连通时 即产生电流
2) 检测器---光电管
光电管 光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.阴极的凹画上有一层光电发 射材料,此种物质经光照射可发射电子.当在两极间加有电位 时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.对 于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.由于光电管具有很高的电阻,所以产生的 电 流容易放大 .
3) 检测器---光电倍增管
光电倍增管 它比普通的光电管*,它可将*次发射出的电子数目放大到数百万倍 .当电子打在兼性阳极上 时,能引起更多的电子自表面射出.这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子.
此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子.这些电子zui后被收集在阳极上.所得到的倍增电流可进一 步加以放大和测量.

1. ,带宽是什么概念，是越宽越好吗？

通常指狭缝宽度，表现为图谱的半峰宽，带宽越小，定性时峰位越明显。某种意义上可理解为仪器的分辨率,理 论上越小越好,但实际由于仪器噪声的影响,带宽越小噪声越大,故需要选择合适的带 宽,一般选择2nm-5nm的带宽来 测试样品(自然界中99%的样品都能准确的测量出).所以购仪器一般要选5nm以下带宽的仪器. 但是，带宽太小，光通量就很小，在分析中也不适用。的选择是带宽可调的仪器，根据自己的实际需要来调整带宽。

1. 狭缝宽度和光谱带宽的关系

狭缝宽度是毫米级的，是光度仪器加工时的物理尺寸；光谱带宽是nm级的，是仪器的重要分光指标，是决定 仪器的分光能力的重要设计指标。通俗的讲光谱带宽就是通过狭缝的光所包含的谱带宽度，是决定仪器分光的 纯度以nm表示。所以狭缝越窄，光谱带宽越小，但不是指只要将狭缝变窄就能达到光谱带宽小，必须同时其 他硬件条件（包括光源/光栅/检测器以及机械系统等）达到这个级别。

1. 专家支招:如何选择紫外？

主要考虑光学构造、光谱范围、样品类型和分析工具。

研究者们有众多的新紫外光可选。自从60年前紫外出现在实验室的工作台之后，这种能 解决广泛难题的仪器可以从单一波长的测量到高性能多光谱进行测量分析。

1;科学家们选择时需要根据自己实验 室的需要和目的用途来考虑

2;光学构造和光源

3;探测方法

4;样品类型

4;数据处理

5;其他要考虑的用户需求因素

光学构造（OPTICAL CONFIGURATION）
一般来说，紫外光分为单光束和双光束两类。顾名思义，单光束型主要是依赖单束光进行测量。一 束给定波长的光通过对照物，然后再通过实际样品溶液，就能得到吸光结果。

双光束型则是通过一个斩光轮（mirrored chopper wheel）将一束光分成两束，分别测量对照样品和实际样品。 可以zui小化光漂移（lamp drift）和减少测量时间。一些双光型光度计不利用斩光轮，而是利用一种光束分光器 来代替，将一束光分成两束平行的光然后同时测量对照样品和目的样品。因为增加了测量的速度，所以双光束 在测量一些溶液随时间动态变化的研究中大有用处。

光源和检测方法（LIGHT SOURCES AND DETECTION）
的光谱也是需要考虑的一个重要因素。实验室研究人员希望省钱购入专门仪器定量核酸、蛋白或者 细菌的生长情况。例如Amersham Biosciences of Piscataway公司的GeneQuant II能在230、260、280、 320、595和600nm的波长下测量样品。如果需要更大的灵活性，研究者可以考虑一种更高性能的宽光谱仪 器，可以程序性地进行ELISAs分析和比色分析。

紫外一般覆盖190nm和380nm波长，通常利用氘灯照明。一些特殊的仪器可以提供满足光子学 和半导体研究需要的光谱范围。Varian of Palo Alto公司的Cary Deep UV和Hitachi High Technologies of Tokyo的U-7000 Automated Vacuum UV System就是这样的仪器。

一些仪器具有多种光源供选择：紫外光、可见光和甚至红外光（780 nm 至3,000 nm）。钨灯和卤素灯一般只 覆盖可见光部分（大约380 nm 到800 nm）。而氙灯则可以覆盖紫外光和可见光区域。

的带宽（bandwidth）很大程度上依赖于单色仪的狭缝的宽度。可以投射出实验要求的光谱。 一种严格带宽使得仪器能对复杂的混合物进行高分辨率的吸光测量。可变的单色仪的狭缝宽度能使一台分光光 度计满足多种实验需要。

为了测量吸光值，制造商通常使用光电倍增管（photo-multiplier tubes，PMTs）和光敏二极管。 PMTs提供快速的反应时间和良好的灵敏度，并且可以在紫外光谱调节至特定的范围。但一些制造商依赖于光 敏二极管的动态范围在数秒内行使所有的光谱测量。

样品类型（SAMPLE FORMAT）
在大部分的样品类型中，可接受样品孔、小玻璃管cuvette、吸浆管和微孔板。微孔板主要是满足高 通量的需要和大规模的实验室需求。但尽管对于小实验室来说，制造商仍然提供了多种容器转换器来满足通量 的要求和减少实验时间。

用小试管cuvette装样品容量一般从1 μl-5ml，并且一些仪器装备了各种样品固定物来满足各种改变需要。体 现了柔韧性。

数据管理（DATA MANAGEMENT）
 大部分单机型的包含了驱动仪器运行和管理数据的软件。高性能的仪器，通常与PC机一起联用，需要从制造商提供额外的软件。同时用户也可以选择升级软件以满足他们的需要。

另外一个值得考虑的因素是数据的zui终使用。各独立实验室都有各自感兴趣的实验结果。例如一些药物机构需 要考虑美国FDA的要求和欧联盟的药物评价机构的要求选择不同的数据处理方式。