病毒感染细胞实验步骤

病毒感染细胞实验步骤，一、病毒的种类
 
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒
 
1.1慢病毒
 
1.1.1原理
 
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
 
1.1.2特点
 
1） 直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
 
2） 可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
 
3） 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
 
4） 无需任何转染试剂，操作简便。
 
5） 可以根据客户需要制备多种标记。
 
1.1.3慢病毒包装简要流程：
 
1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。
 
2） 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
 
3） 培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
 
4） 病毒的纯化和浓缩。
 
5） 分装、- 80 ℃保存。
 
6） 滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
 
1.2、腺病毒
 
1.2.1原理
 
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的控制系统。
 
1.2.2特点
 
1） 几乎可以感染所有类型的细胞
 
2） 可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失)  的腺病毒
 
3） 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。
 
4） 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单.
 
5） 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
 
1.2.3腺病毒包装简要流程
 
1） 构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体
 
2） 采用 PacI 消化纯化的质粒。
 
3） 消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
 
4） 将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
 
5） 分装，-80℃保存。病毒感染细胞实验步骤