ELISA操作要点

 ELISA 技术的-操作要点

的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因
固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA 各个操作步骤的
注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严
格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
4.1 标本的采取和保存
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等
均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预
处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝
剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收
缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA 中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以
HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假
阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。
一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清
融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，
不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反
复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰
存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
4.2 试剂的准备
按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，
应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温
平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
4.3 加样
在 ELISA 中一般有3 次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA
板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也
可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀
释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡 1 分钟
以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
4.4 保温
在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的
温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA 中似不恰当。
ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板
孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有zui贴近孔壁的一层溶液中的抗原直
接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体
与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA 反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也
是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELI SA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反
应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在 43℃进
行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形
成zui多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA 中一般不予采用。
保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA 板置于水浴箱中，
ELISA 板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板
孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料
如金属等，在盒底垫湿的纱布，zui后将ELISA 板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温
度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温
度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指 20-25
℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注
意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。
4.5 洗涤
洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分
离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以
及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而
在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是zui主要的关键
技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种，过程
如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔内反应液；b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；c.浸
泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应
*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c 和d，洗涤3-4
次（或按说明规定）。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白
质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借
疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复
到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20，其浓度可在0.05%-0.2%
之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
（2）流水冲洗式流水冲洗法zui初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时
附接一特殊装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸
泡2 分钟，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为*，且也简便、快速。
已有实验表明，流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流
冲击板孔表面，洗涤效果更佳。
4.6 显色和比色
4.6.1 显色
显色是 ELISA 中的zui后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍
是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高
温度有助于加速显色进行。在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的
显色可在室温进行，时间一般不需要严格控制，有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短
或延长反应时间，及时判断。
OPD 底物显色一般在室外温或37℃反应20-30 分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。
OPD 底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应。OPD 产物
用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。
TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，
宜在规定的适当时间阅读结果。T MB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达，随即逐渐减弱，至2 小时后
即可*消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应
终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类
酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
4.6.2 比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。以软板
为载体的试验，需先将板置于标准96 孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边缘
剪净，这样，此板就可*平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或
稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各
孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。
比色结果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者
含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A 字母的右下角，如OPD 的吸收波长为492nm，表示方
法为"A492nm"或"OD492nm"。
4.6.3 酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读 ELISA 结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，
各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测
读速度、读数的准确性、重复性、度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可到0.0 01，
准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A 值为1.083，则该孔相对于空气的真实A 值应为
1.083± 0.01（1.073~1.093），重复测定数次，其A 值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可
测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在0.000~2.000，新型号的酶标仪上限拓宽达2.900，甚至
更高。超出可测上限的 A 值常以"*"或"over"或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同，线性范
围常小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.000~2.900，而其线性范围仅0.000~2.000，这在定量
ELISA 中制作标准曲线时应予注意。
酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在 15~30℃，使用前先预热仪器
15-30 分钟，测读结果更稳定。
测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即
每孔先后测读两次，*次在zui适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不移动ELISA
板的位置。例如OPD 用492nm 为W1，630nm 为W 2，zui终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长
式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细新闻记者说明书。
4.7 结果判断
4.7.1 定性测定
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出 "有"或"无"的简单回答，分别用"
阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得
到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作
一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的zui高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强
弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法 ELSIA 中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA 中则相反，阴性孔呈色深于
阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。
（1） 间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。
但在 ELSIA 中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而
异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断
结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数
据。先读出标本（ sample，S）、阳性对照（P）、和阴性对照（N）的吸光值，然后进行计算。计算方法
有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。
a． 阳性判定值
阳性判定值（cut-off value）一般为阴性对照A 值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性
的标准。
用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的
规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量
标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg 的
复钙人血浆，阳性对照品HBsAg 的含量标明为P=9±2ng /ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。
测得A 值后，先计算阴性对照A 值的平均数（NC X ）和阳性对照A 值的平均数（PCX），两个平均数的
差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.400），试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应≥0.5×NCX，并≤1.5
×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照A 值超
出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：
阳性判定值=NCX+0.05
标本 A 值＞阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05 为该试剂盒的
常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作
不当均会产生"试验无效"的后果。
b.标本/阴性对照比值
在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（ S）和阴性对
照（N）的A 值后，计算S/N 值。也有写作P/N 的，这里的P 不代表阳性（positive），而是病人（pati ent）
的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N 表示。在早期的间接法ELISA 中，有些作者定出S/N 为阳性
标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值。更应注意的是，
N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较
底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如 N<0.05
（或其他数值），则按0.05 计算，否则将出现假阳性结果。
（2）竞争法
在竞争法 ELISA 中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞
争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间，此时反应zui为敏感。
竞争法 ELISA 不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比
色计测定，读出S、P 和N 的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照 A 值，现举某种检测抗
HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc 的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc 含量为125±1
00u/ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。测得A 值后，先计算阴性对照A 值的平均值（NC X ）
和阳性对照A 值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例如0.300）,试验
才有效。3 个阴性对照 A 值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX 并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则
弃去，而以另2 个阴性对照重新计算×NCX；如有2 个阴性对照A 超出以上范围，则该次实验无效。阳性
判定值按下式计算：
阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
标本 A 值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：
抑制率（%）= （阴性对照A 值-标本A 值）×100%/阴性对照A 值
一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性。
4.7.2 定量测定
ELSIA 操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一
致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标
准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线zui高点的吸光度
可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的
值逐点连接，所得曲线一般呈 S 形，其头、尾部曲线趋于平坦，*较呈直线的部分是
的检测区域。
测定小分子量物质常用竞争法（参见 2.2），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相
关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。
ELISA 技术中的抗原与抗体的反应
抗体
1.2.1 抗体的结构
抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白 （immunoglobulin,Ig）。Ig 分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD
和IgE。与免疫测定有关的Ig 主要为 IgG 和IgM。Ig 由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig
的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda ）两种型别。五类Ig 的重链结构不同，这决定了它们的抗原
性也不同。IgG 和IgM 的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu ）链。
重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH 和VL 表示。两者构
成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原
的结构基础。
IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab 都保存
结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称
Fc 段，无抗体活性，但具有IgG *的抗原性。
IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab 双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片
段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。
IgM 是由五个单体组成的五聚体，含 10 个重链和10 个轻链，具有10 个抗原结合价，由于空间
位置的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM 分子量约为900000， IgG 分子量约为150000。
机体被微生物感染后，先产生 IgM 抗体，然后产生IgG 抗体。经过一段时间，IgM 抗体量
逐渐减少而消失，而IgG 抗体可长期存在，在疾病*后可持续数年之久。
IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM 抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎
有较高的临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中IgG 抗体和IgM 抗体出现的时间和水平。
1.3 抗原抗体反应
1.3.1 可逆性
抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：
Ag+Ab→Ag·Ab
抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K 表示：
K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]
Ag·Ab 的解离程度与K 值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，
两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯
抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG 抗体仅占总IgG 中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体，
称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。
1.3.2 zui适比例
在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗
体比例zui合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。
如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量
称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中
有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。
1.3.3 特异性
抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构
和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（ HBsAg）、
e 抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合，而不与另外两
种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定
某一特定的物质，而不需先分离待检物。
但是这种特异性也不是的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉
反应。例如：绒毛膜促性腺激素（ hCG）和黄体生成激素（LH）均由α和β两个亚单位组成，其结构的不
同处在β亚单位，而两者的α亚单位是同类的。用hCG 免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG
两种抗体，抗α-hCG 抗体将与LH 中的
α酶位发生交叉反应。在临床检验中，如用抗hCG 抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG，只能用于hCG
浓度较高的试验，否则妇女生理性排泄入尿液中的微量 LH 将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断（敏
感度应达到50mIu/mlhCG）的实际中必须应用只对 hCG 特异的抗β-hCG，以避免与其它激素的交叉反应
的发生。
1.3.4 敏感性
在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为 mg/ml 水平，酶反应测定法的敏感度约为
5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高
数千倍，达ng/ml 水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1ng /ml。
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体
作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定：
1） 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。
2） 激素，包括小分子量的甾体激素等。
3） 抗生素和药物。
4） 病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等。
5） 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等。
5．标记的免疫测定
如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度
可达 5~10μg/ml，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度
的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来
提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别为放射性核素和酶，zui后用测定放射性和酶活
力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中， 一般加入过量
的标记试剂以保证与待测物*反应。以标记抗体（Ab ※）检测抗原（Ag）为例，反应式如下：
Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※
在反应产物中有与 Ag 结合的Ab※和游离和Ab※ ，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两
者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段，固相载
体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物
被固定在载体上，而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的 Ab ※除去，结合标记物的测
定可在固相上进行。
6．酶免疫测定
酶免疫测定（enzyme immunoassay）可分为均相（homogenous）和非均相（heterogenous）两种类型。
在均相EIA 中可不需进行游离的和结合的标记物的分离而直接测定标记物。例如在某种条件下，抗原抗
体反应后形成的酶标记抗原抗体复合物中的酶失去其对底物作用的活力，因而测出的酶活力直接反映游离
的酶标记物。均相EIA 在临床检验中较少应用。非均相EIA 需*行游离的和结合的标记物的分离。如
前所述，固相载体可用作一种分离手段。这种固相酶免疫测定方法在1971 年zui初建立时称为酶联免疫吸附
剂测定（enzyme linked immunosorbent assay），简称ELISA，在国内有译作酶联免疫吸附试验的，虽然含
义不*确切，但已习用。
ELISA 临床质量评价与质量管理
ELISA 试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价，符合一定要求后才能生产供
应；一是在临床应用中效果的评价。以肝炎ELISA 诊断试剂为例，首先必须通过中国药品生物制品检定，
以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、说明书等外，对试剂的性能，如特异性、灵敏度、精密度和
线性等均需逐项检定，通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才为合格。ELISA 试剂的临床质量评
价是用该试剂对临床样本进行检测，以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA 诊断试剂在这方
面进行了工作，通过质量评价，促进了试剂质量的提高。
6.1 诊断试剂临床质量评价要点
从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难
找到 100%可靠的试验，任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作
为考核标准。临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示，特异性以无病者试验阴性的百分率表
示。
进行这种评价，首先需要收集有关的病人血清，然后用*的检测该项标志物zui可靠的试剂进行测定，
以确定其为阳性或阴性。
这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）。被评价的试剂测定此血清所得结果与
血清盘标明的结果的关系如下表：
血清盘结果
＋ －
合计
受检试剂结果 ＋ a b a+b
－ c d c+d
合计 a+c b+d A+b+c+d
表中a 为真阳性，b 为假阳性，c 为假阴性，d 为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：
灵敏度（%）=a/（a+c）×100%
特异性（%）=b/（b+d）×100%
符合率（%）=（a+d）/（a+b+c+d） ×100%
一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。
6.2 临床考核血清盘的制备要求
1、采用人的原血清；
2、血清盘应具有相应的稳定性；
3、血清盘中样本不含防腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；
4、血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；
5、阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；
6、血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。
7、血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF 因子）的样本，
以检验试剂的特异性。
6.3 临床考核血清盘的建议
以抗 -HBc-IgM 为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国abbott 公司抗-HBc-IgM 试
剂反复检验筛选。选出血清 70 份，其中阳性29 份，阴性41 份，组成抗-HBc-IgM 临床考核血清盘。在
70 份样本中，除7 份为无病历的质控血清外，抗-HBc-IgM 阳性的22 份样本中含临床诊断急性肝炎16 例、
慢性活动性肝炎5 例、重症肝炎1 例；抗-HBc-IgM 阴性的40 份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎24
例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8 例（其中5 例为恢复血样）。
因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，
具有临床诊断意义。
质量管理
ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、
结果判断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测，既可以做定性试验也
可以做定量分析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA 的影响因
素较多，加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。
分析前质控
●人员培训 实验是人操作的，因此检验人员需经过培训，熟练掌握本专业如下几方面的技术知识：
◎检验项目的基本原理 （ELISA 原理）；
◎临床意义；
◎熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；
◎熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；
◎ 熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。
◎某些特殊项目的检测如抗 HIV 等需经有关部门组织的专门培训班，考试合格后持证上岗。
分析前质控
◎ELISA 原理：1971 年Engvall 等人把免疫组化的EIA 技术应用于临床检验发展为ELISA 技术。
特点 ：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"
酶标记免疫活性物质，进行信号放大；
有二步温育反应二次洗涤过程；
灵敏度特异性相对较高。
局限性：只能检测到 ng 水平
精密度差（批内CV15-20%）；
线性范围窄（一个数量级）；
存在"HD-HOOK"效应。
ELISA 原理
●根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方法。
●双抗体（原）夹心法 检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固
相载体和酶标抗体检测溶液中的抗原（适用于二价以上抗原,不能测小分子半抗原）。
●间接法 检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的抗体。
●竞争法 检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，
结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。
ELISA 原理
今后的发展方向
●聚苯乙烯表面的制备。已有的技术是酰肼化（聚二氟乙叉，PVDF）；生物素化；预包被多聚赖氨酸
等，均是产品。
●酶促信号放大的改变，如酶促荧光、酶促化学发光等。
ELISA 临床意义
●各型肝炎的特征及标志物
乙肝二对半的模式及临床意义
HBsAg HBeAg HBcAb-IgG HBcAg-IgM HBeAb HBsAb &n bsp; 临床意义
+ + - - - - 急性HBV 感染早期HBV 复制活跃
+ + + + - - 急慢性HBV 感染，HBV 复制活跃
+ - + + - - 急慢性HBV 感染，HBV 复制中跃
+ - + + + - 急慢性HBV 感染，HBV 复制低跃
+ - + - + - HBV 复制停止或极低
- - + + - - 平静的HBV 携带状态，HbsAg
- - + - - - HBV 既往感染，未产生抗-HBs
- - + + + - 抗HBs 出现前期，HBV 复制低
- - + - + + HBV 感染恢复期
- - + - - + HBV 感染恢复期
+ + + + - + 不同亚型ＨＢＶ再感染
+ - - - - - ＨＢＶ－ＤＮＡ整合
- - - - - ＋ 病后或接种疫苗后获得免疫
试剂盒选择
◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定
所检定合格，并贴有防伪标签的产品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经
济性作出全面的评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的zui低量的能力；2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出
的能力（假阴性越少越好） ，取决于包被物的全面性。
◎特异性：指试剂正确检定不存在的被检物质的能力（无假阳性），取决于包被抗原（体）及标记抗原（体）
的纯度及特异性。
◎精密度：ELISA 试剂一般指其批内CV，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围
试剂盒选择
◎稳定性：试剂在规定条件下能储存的时间，一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存，定期测定其
灵敏度，特异性和精密度等指标，直到其质量指标开始下降为止，通常认为 37℃每稳定一天相当于4-10
℃保存一个半月。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性试验中结果判断简单
明了，）定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。
试剂盒评价
◎试剂评价需要有的血清考核盘（ Panel）进行检测，一般实验室不易从生检所或临检中心取得，
每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选择。
◎根据该试剂生检所批批检定报告，了解其质量水平，按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂；
◎通过询问试剂包被物的组成，如原料来源（基因工程或合成多肽），片段的组合（按比例混合或化学合成），
片段的长短等判断试剂的优劣；
◎参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果，这比较客观公正，因为统计数字均来自各参评医院，反映了
试剂在某一地区的使用情况；
◎根据部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。
仪器质控
为使仪器保持*工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器
（加样枪），水浴箱（温箱），洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA 加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：吸取刻度指示
量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±10%以内；
◎水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；
◎洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检
查管孔是否堵塞；
◎酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
附1：酶标仪校正程序
◎滤光片波长精度检查：将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下，用UV-2201 型紫外-可见分光光度计（波长
精度±0.3nm）于可见光区对每个滤光片进行扫描，其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。
◎通噵差与孔间差检测：通道差检测是取一只酶标板小孔杯（杯底须光滑，透明，无污染以酶标板架作载体，
将其（内含200ul 甲基橙溶液吸光度调至0.500A 左右）置于8 个通道的相应位置，蒸溜水调零，1 于490nm
处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性，可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同
一厂家，同一批号酶标2 板条（8 条共96 孔）分别加入 200ul 甲基橙溶液（吸光度调至0.100A 左右）先
后置于同一通道，蒸溜水调零,于490nm 处检测，其误差大小用±1.96s 衡量。
n 零点飘移（稳定性观察）：取8 只小孔杯分别置于8 个通道的相应位置，均加入200ul 蒸溜水并调零，
于490nm 处每隔30 分钟测一次，观察各个通道4 小时内吸光度的变化。
附 1：酶标仪校正程序
◎精密度评价：每个通道3 只小杯分别加入200ul 高中低3 种不同．浓度的甲基橙溶解，蒸溜水调零，于490nm
作双份平行测定，每日测二次（上下午各一次），连续测定 20 天。分别计算其批内精密度，日内批精密
度,日间精密度和总精密度及相应的CV 值。
◎线性测定：用电子天平称取甲基橙配制 5 个系列的溶液，于490nm 平行测8 次，取其均值。计算其
回归方程，相关系数及标准估计误差 s，并用±1.96s 表示样品测量的误差范围.双波长测定评价：取一分甲
基橙溶液，分别加入3 种不同浓度的溶血液（测定波长为 490nm，校正波长为585nm），先后于8 个通道
检测，每个通道测3 次，51 比较各组之间是否具有统计学差异，以考察双波长消除干扰组分的效果。
◎一般酶标仪无 585nm 滤光片，可选用550nm 或630nm 滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液（校
正波长为630nm）
常见酶标仪评价
标本的采集和保存
◎可用作 ELISA 的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪
便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。
n 标本采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果，可造成
假阳性；长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
◎抗凝不*的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。
◎标本在冰箱中保存时间过长易导致血清 IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5 天内
完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。
◎ELISA 的灵敏度>1ng/ml 水平上,标本间的污染要尽量避免，尤其不应与生化试验用同一管标本.zui起码应
先做免疫后做生化.
附：内外干扰物质的影响分析
溶血 脂浊 RF 自身抗体 AFP 补体 & nbsp; 肝素 ; EDTA
A 0.165 0.200& nbsp; 0.250 &n bsp; 0.264 &nb sp; 0.186 0.146 0.183 0.126
S 0.023 0.016& nbsp; 0.007 &n bsp; 0.029 &nb sp; 0. 010 0. 007 0.019 &nbs p; 0.013
A 对照0.151 0.195 ;0.195 0.195 & nbsp; 0 .116 0.116 0.116 0.116
S 0.038 0.008& nbsp; 0. 008 0.008 &nbs p; 0.018 0.018 &n bsp; 0.018 0.018
P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 <0.01 <0.01
分析中质控
◎ELISA 实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责
才能充分发挥ELISA 的高灵敏，强特异的优点。
◎因此,应建立实验项目的标准操作程序（SOP）。
加样
◎加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板的1/3 处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不
可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振
荡器上振荡30 秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去*滴有气泡的试剂后加样。
温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA 边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能 使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放
在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3 处，不可将板条叠加放置。
◎边缘效应（2ng/mlHBsAg 一步法三种不同温育法的结果）
洗涤
◎ELISA 是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸
附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；
2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；
3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3 分钟，间歇摇动；
4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5 次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体
全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2 次以上。关机
前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。
显色
◎HRP 催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般为 37°C，10-15 分钟）恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达 0.2 左右使的时间而恒定反应时间.
酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色（30 分钟内）。
常见的显色系统有OPD 和TMB 二种，以后者zui为常见，而TMB 酸不易终止因此必须尽快比色以免
影响结果。OPD 终止后显棕色， 测定波长为 490nm；
TMB 终止后显黄色，测定波长为450nm，
二种底物的校正波长均用6 30nm。
使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶
标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。
报告方式
◎定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O 方式报告，S 为标本A 值，C.O 即Cut Off 值（阳性判定
值）
◎夹心法和间接法以S/C.O≥1 为阳性；
竟争法与中和法以S/C.O﹤1 为阳性
◎Cut Off 的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有：
◎A） C.O=2.1×N（当N 不足0.05 时按0.05 计），
◎此公式由 P/N>2.1 换算而来，常用于夹心法。
◎B） C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来，
◎常用于竟争，中和法
◎C） C.O=N+C（C 为常数），用于间接法。
◎D） C.O=C×P+N（C 为常数），用于间接法。此公式zui客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定
值要基本恒定。
报告方式
定量分析 用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA 测定，绘制标准曲线，结果以量或单位表示。
ELISA 的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。
◎现有的 ELISA 定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到的结果实属不易。
因此严禁用定性试剂盒做定量分析。
灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO 值上下的一段区域定为阳性可疑，需重
复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种：
1）C.O×（1±CV） ，
CV 为该试剂的批内CV& nbsp; （一般在15-20%间）；
2）C.O±2s，s 为实验室做室内质控ROC 的s 。
高值钩镰效应（HD-HOOK）
◎在二位点夹心 ELISA 中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状
无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（197 4）根据此现象写实性地称
之为"HD-HOOK"效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。
质量控制（Quality Control，QC）
◎英国 Whitehead 教授建议生化检验工作的质量控制分为4 个步骤：*条件的变异（OCV）；常规
条件的变异（RCV）；病人结果的统计（SPR）；室间质量控制（EQA）。前三个步骤即室内质量控制（IQC）。
◎在 GLP 概念里QC 即指IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作
的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是
否可靠或可否发出的一项工作。
◎免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此QC 手段不能照搬生化模式。分为定性和定量
二个方面。
质量控制（Quality Control，QC）
定性试验：ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体，与检出量无关，因此QC 要保证试验
的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。
建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质
控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O≥1，高值质控血清 S/C.O≥10，正常人血
清A 值在0.05~0.07 之间。
◎阳性质控血清失控（临界值为灵敏度，高值为"HOOK"效应监控）应重做阴性标本；阴性对照失控应重做
阳性标本。
◎以表格式记录每块板的外对照实验结果，作为 QC 资料存档。
质量控制（Quality Control）
◎定量试验： ELISA 定量试验常见于肿瘤因子（如AFP，CEA，CA 系列），激素类，免疫球蛋白类，这
些物质在体内有一定的量（正常范围），超出这个量才呈病理情况，故需定量测定。定量试验的质控方法
可参考生化方式。
质量控制（Quality Control）
"即刻性"质控：在开始进行质控时，只需要有3 个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20
次有效值时就可以计算RCV 的X，s。方法：
（1）先将测定值从小到大排列，X1 zui小，Xn zui大；
◎（2）计算X 和s；
◎（3）计算SI 上限值和下限值。
◎SI 上=（X zui小-X）/S， SI 下=（X zui大-X）/S
◎对照SI 表，检查是否出控，
SI 上、下限≤规定值，在控；
SI 上或下限>规定值，失控。
质量控制（Quality Control）
SI 值表（即刻性质控）
N 3 &nbs p; 4 5 6 7 8 &nbs p; 9 10 11
N（3s） 1.15 1.49 1.75 1.94 &n bsp;2.10 2.22 2.32 2.41 2.48
N （2s）1.15 1.46 1.67 1.82&nbs p; 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23
12 13 14 15 16 &n bsp; 17 18 19 20
2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 &n bsp; 2.85 2.88
2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 &n bsp; 2.53 2.56
室内质控血清的制备：
◎收集阳性血清（无明显溶血、黄胆、脂肪血和污染血清,到一定量（够本室使用3-6 个月的量）；
◎传染性病毒阳性需经 56℃、10 小时灭活后使用；
◎过滤，除纤维沉淀物；
◎稀释，用正常人血清或 10%小牛血清PBS 溶液稀释；
◎测定值，与定值参考品进行对比、求值，一般定在 Cut Off 值附近的阳性值；
◎分装小瓶（每日用量），加盖、贴签，-20℃冻存备用。
不使用质控血清的室内质控
◎操作过程的质量控制（分析前、后质控）
◎试剂盒阴阳性对照或标准浓度系列。
阴对≤0.05 阳对-阴对>0.8 标准浓度落在2s
阳对 > 0.80 &n bsp; &n bsp; ; 范围内
◎病人资料统计，连续观察病人检测结果的资料，并分析该病人其他化验结果的关系。
质量保证
（Quality Aprovment，QA）
◎质量保证的核心内容是室间质评。室间质评是一种回顾性评价，主要控制试验结果的准确性，也是某
些定量试验量值朔源。
评价方法
◎1）发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定
的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心）。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实
验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打修改结果而
达不到真正评价作用。
◎2）现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。
这种方法可以解决实际问题， 进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。
成绩计算方法
◎定性试验：检验结果与预期结果一致，得 100 分，错误不得分，总计实验室的得分。从全部参评单
位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s），再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI）
SI=（实验室得分-平均分X）/平均标准差（s）
SI 在0.0-0.9 间为良好,1.0-1.9 间为,SI 为负值时数值越大成绩越差。
◎定量试验
SI=（实验室测定值-预期值X）/预期值的标准差s ; SI 越小，表明越靠近靶值，成绩越好。
0-1.0 为,1.1-2.0 为良好,>2.0 为差。SI 无正负之分
质量改进（Quality Improvement，QI）
◎质量改进的建议来源于三方面：
◎（1）室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；
◎（2）室间质评：提示实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；
◎（3）病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。
记录
◎所有实验的原始资料均应存档； 所有的记录均应规范登记在册； 原始登记表应记录试剂来源、批号；质
控血清的来源及测定值并注明是否在控；签上实验者姓名及审核者姓名。
◎如试验结果对临床诊断有决定意义，其样本应保留，至少与病历保存期一致。
ELISA 原理与分类
1. ELISA 的原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保
持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测
定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体
复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固
相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产
物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很
高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA 的类型
ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌
素原或抗体，即"免疫吸附剂 "（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；
（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测
方法。用于临床检验的ELISA 主要有以下几种类型：
2.2.1 双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，操作步骤如下：
1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他
未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。*洗涤未结合的酶标抗体。此
时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗
原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标
用的抗体分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，
分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶
标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不
再形成 "夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩
带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实
际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重
时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例
如血清中HBsAg、AFP 和尿液hCG 等）时，应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此
类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的a 决定簇，也可用针对此决定
的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg 的检测中应注意亚型问题，HBs Ag 有adr、adw、
ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为IgM 型，
能和多种动物IgG 的Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有R F，它可充当抗原成份，同
时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去
除了Fc 段，从而消除RF 的干扰。双抗体夹心法ELISA 试剂是否受RF 的影响，已被列为这类试剂的一项
考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，
因其不能形成两位点夹心。
2.2.2 双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接
法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其
敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据
抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
2.2.3 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相
抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图 2-3）。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经
洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig 以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG 检测IgG 抗体。固相免
疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检
抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用
同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能
予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以 E.Coli
为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli 成份，很可能与受过E.Coli 感染者血甭中的抗E.Coli 抗体发生反
应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig
去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性 IgG 只占
总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗
原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭
（blocking）固相上的空余间隙。另外， 在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性
本底影响结果的判断。
2.2.4 竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原
理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗
体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，
直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。
洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标
本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起
加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗 HBe 的检测
一般采用此法。
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以
采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈
多，结合在固相上的酶标抗原愈少，zui后的显色也愈浅。小分子激素、药物等 ELISA 测定多用此法。
2.2.6 捕获包被法测抗体
IgM 抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA 一般仅适用于检测总抗体或IgG 抗体。如用
抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG 抗体，后者将竞争结合固相
抗原而使一部份IgM 抗体不能结合到固相上。因此如用抗人 IgM 作为二抗，间接测定IgM 抗体，必须先
将标本用A 蛋白或抗IgG 抗体处理，以除去IgG 的干扰。在临床检验中测定抗体 IgM 时多采用捕获包被
法。先用抗人IgM 抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM 抗体和非特
异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM 相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再
与底物作用，呈色即与标本中的 IgM 成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）
抗体的检测模式见图2-7。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM 抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG 的间接法近
来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM 和抗弓形虫IgM 抗体已获成功。
2.2.7 ABS-ELISA 法
ABS 为亲和素（avidin）生物素（biotin）系统（system）的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由
4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素- 羟基
琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与
亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个
亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把ABS 与ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥
联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA 系统中的酶
标抗体（抗原）。在LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步
提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，
用于ELISA 中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA 应用中有替代前者的
趋势。由于ABS-ELISA 较普通ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA 应用
不多。
ELISA 质量控制
从 1949 年美国College of American Pathologists（简称CAP）首先开始研究临床实验室室内
质量控制（简称质控）问题，美国学者Levery 和Jenn ing 于1950 年发表*篇关于使用质控图
的实验室室内质控，临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。
到 70 年代，实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理，推行Good Laboratory Parctice
（简称GLP）。进入80 年代末期，GLP 的统一标准产生了，发展到"认证实验室"管理阶段。
全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学
的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。
本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为ELISA 是目前临床上zui常用的一
种免疫学检验方法，就以ELISA 检验为例，介绍一下有关问题。
卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988 年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量
评价活动，一直采用这一套质量评价方法，并在实践中不断实践、提高和完善， 希望能找出一
条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路。
5.1 基本概念
5.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C）
质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这一过程是通过一
个反馈环路进行的。
1）确定控制的对象；
2）规定控制对象的标准（预期值）；
3）制定或选择控制方法和手段；
3）测量实际数据；
4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预
定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。
质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的 "控制限"进行
比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变
异的"可追查" 性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计
计算出来的，在后我们将详细介绍（见5 .3.室内质控程序）。
5.1.2 误差
实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。
系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律性，可在一定条件
下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。
随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误差。检验工作中
随机误差的分布符合正态分布规律。
过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免的。
5.1.3 正态分布及标准差
ELISA 试验中，检验同一样本达20 次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光值）分布在均值
两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟
形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为中心对称分布，这就是正态分布。
正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数（X）和标准差（SD）来表示，其计算方法如下：
均值、标准差和概率的关系如下：
X±1SD，概率0.68 X±2SD，概率0.95 X±3SD，概率0.99
换言之，当 ELSIA 检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的±1SD 范围内
的数据，占该组数据的68%，在X±2 SD 范围内分布的数据占总体的95%，在X±3SD 范围内分布的数据占
总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD 范围内为合格时，将有 95%的数据可能合格。
5.1.4 真值
用确切的、的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可靠的决定性方法
测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。
5.1.5 准确度（accuracy）
是指测定结果与真值（或靶值）接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确度来衡量。测定
结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。
偏差=检验的均值-真值（或靶值）
相对偏差=偏差真值÷（或靶值）×100%
5.1.6 精密度（Precision）
是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间
的符合程度。
5.1.7 标准品
1、标准品由WHO 或相应组织标定的，用肯定的、*的、准确的物理或化学方法测定的定值材
料。
2、生物学活性标准品根据生物学反应由WHO 或相应组织标定的活性单位的材料。
3、参考标准血清国家标准化组织根据标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和鉴定方法准确性。
5.1.8 临床决定性水平（clinical decision leuel）
当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度称为临床决定性
水平。
5.2 质量控制血清
质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的
情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出
现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因， 纠正后，重检待测标本。因此质控血
清在质控工作中起重要作用。
5.2.1 质控血清的使用
卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在 -20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使
用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5 天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工
作需要的质控血清，一般按3-6 个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需
准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样
才能有效地起到监测作用。
5.2.2 临界值质控血清
质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定
性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判
断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它
可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
5.2.3 质控血清的制备
每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备
本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。
1）收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2） 56℃加热10 小时来活。
3） 离心或过滤除去沉淀。
4） 用 10%的小牛血清或正常人血清（PBS 缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如
能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5） 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。
被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要
求，则应加所要求浓度的质控物。
6） 标定含量。20-30 次测定结果删除>±2SD 数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对
比测定。
5.3 室内质量控制程序
临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能*。决定允许的误差范围，以临床上不造成误诊
与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。
1） *条件下的测定误差。
2） 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3） 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4） 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要求。如允许误差
定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反，如果将
允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差， 失去质控的意义。
5.3.1 *条件下已知值质控血清变异（optimal conditions variance,简称OCV）的测定
在本实验室*条件下（包括操作者、试剂、仪器等）检测质控血清 20-30 次，测得结果计算，求出
该组数据的均值和标准差（SD）表示该实验室的*工作质量。
现举例说明 HBsAg ELISA 法检测时OCV 的测定。使用的质控制血清为临界血清，HBsAg 浓度为
5ng/ml。在该实验室中选择素质、操作zui熟练的技术员进行认真地专门测定，选用*的试剂盒，检
测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等，即在*、的条件下
进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定，得出2 个吸光值（A 值），
求出 X。连续作20 次，求出20 个X，即X1……X20。从这20 个数据中，求出OCV 的X 和SD。
5.3.2 常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称RCVK）的测定。
做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行 20 次检验，
结果计算同OCV 法。一般认为RCV 的SD 在OCV 的SD 两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使
其向OCV 的 SD 值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重
新进行RCVK 的测定。如果RCVK 的S D 值更小，说明OCV 不是*条件下测定的，应重新再测OCV。
常规条件下，RCVK 肯定要比OCV 大。通过质控控制各项条件， 使 RCVK 的数据尽可能接近OCV 值。
RCVK 的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结
果，报告能否发出。
5.3.3 常规条件下,未知值质控血清变异（routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU）的测定
有时为了避免主观性,再作RCVU 测定。
测定步骤同 RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件
下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
5.3.4 质控图
通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据 RCVK 的和SD 作质控框图。利用质控图可以对每次
检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。
质控血清的 S/CO 值低于-2SD 的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。
ELISA 试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，
不是定论。2SD 是一般*的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过 2SD 应作为"告警"，
二次超出2SD 为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血
清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不
到原因时，应重复进行OCV 的检验。如果OCV 检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。一般认为：
①一次超出 3SD；②连续二次超出2SD；③3-5 次连续处于一侧的2SD 之内；④5～7 次连续偏向横轴的
一侧，均为失控。第③、④ 种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种
失控。
5.3.5 统计学计算方法--"即刻性"质控
以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但 ELISA 有其特殊性，zui合适的质控方
法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA 项目的检验，而ELSIA 试剂盒效期短，用一批号试剂
盒连续常规测20 次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3 次，即可对第3 次检验结果进
行质控。" 即刻法"的建立具体计算方法如下：
1）先将测定值从小到大排列
2）计算X 和SD。
3）计算SDI 上限和SDI 下限值。
4）将SDI 上限、SDI 下限值与SDI 值中的数字比较。
当 SDI 上限值和SDI 下限值＜n2SD 时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各
项计算；当SDI 上限和SDI 下限有一值处于n2SD 和n2SD 值之间时，说明该值在2SD~3SD 范围，处于"
告警"状态；当SDI 上限和SDI 下限有一值＞n2SD 时，说明该值已在3SD 范围之外，属"失控"。数值处
于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次
测定值仍可继续使用。
即刻性质控统计方法，适于 ELISA 测定的质控。
当检测的数值超过 20 次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将
前20 次的数值求出的和SD 作质控框架图，第2 1 次的数值，依次点入即可。
5.4 室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）
室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结
果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。
各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天
发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验
结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。
5.4.1 室间质评的方法
1、发质控物进行调查
这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物 ELISA 检验的室间质评采用定期发放质控
物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，
将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高
检验质量。
这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的
技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使 EQA 的结果不能反映该实验室日常工作水
平。
2、派观察员到实验室进行试剂调查
这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，采用常规方法，检验规定的一组
标本，进行评价。
这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验
质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。
如何选择ELISA 试剂？
在临床检验中一般采用商品试剂盒进行测定。前文（2.2）已述，ELISA 中有三个必要
的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。
完整的 ELISA 试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及标本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
3.1 免疫吸附剂
已包被抗原或抗体的固相载体在低温（ 2~8℃）干燥的条件下一般可保存6 个月。有些不完整的试盒，
仅供应包被用抗原或抗体，检测人员需自行包被。以下简述固相载体和包被过程。
3.1.1 固相载体
固相载体在 ELISA 测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA 中载体的材料很多，
zui常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来
的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式。
ELISA 载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板zui为常用，于EILSA
的产品称为ELISA 板， 上标准的微量滴定板为8×12 的96 孔式。为便于作少量标本的检测，有制成
8 联孔条或12 联孔条的，放入座架后，大小与标准 ELISA 板相同。ELISA 板的特点是可以同时进行大量
标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的 ELISA
检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附
性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测
抗体时空白值较大。
良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板
各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELIS A 板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因
此，每一批号的ELISA 板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为
10ng/ml）包被ELISA 板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG 抗体，保温后洗涤，加底物
显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8 左右。计算全
部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于 10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价
廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，
但空白值也略高。
为比较不同固相在某一 ELISA 测定中的优劣，可应用如下的试验：用其他免疫学测定方法选出一个典
型的阳性标本和阴性标本，将它们进行一系列稀释后， 在不同的固相载体上按预定的 ELISA 操作步骤进
行测定，然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别zui大，这种载体就是这一 ELISA 测定
项目的zui合适的固相载体。
在 ELISA 中，用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm 的圆珠，表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。
ELISA 板孔的吸附面积约为 200mm2，小珠均为1000mm2，将近ELISA 板孔的5 倍。吸附面积的增大即
意味着固相抗原或抗体量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点
的暴露面处于*反应状态，因此珠式ELISA 的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻
底，使用特殊的洗涤器，使小珠在洗涤过程中滚动淋洗，其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工
艺的难度较大，小珠的均一性较差。
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面，而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式 ELISA 的标本
量一般为100-200ul，而小试管可根据需要加大反应体积，标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小
试管还可以当作比色杯，zui后直接放入分光光度计中比色。
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为 ELISA 固相载体的。其优点是表面积极大，反应在
悬液中进行，其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA 固相载体，反应后用磁铁的吸引进
行分离，洗涤方便，试剂盒一般均配以特殊仪器。
3.1.2 包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被 （coating）。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过
程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体
表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。
载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更
易吸附到固相载体表面。IgG 对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc 段上，抗体结合
点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。
当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在
这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，
其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充
分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较
多的抗原也可采用捕获包被法（见2.2.4），试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接
包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10 乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质
抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA 抗体时，需用DNA 作为包被抗原，而普遍的固相载体
一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如 30W 紫外灯，75cm 照射12 小时），
以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合
力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的 DNA，这种包
被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA 板孔中，开盖置
冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA 试剂一般采用
这种包被方式。
3.1.3 包被用抗原
用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原
可取自动物组织、微生物培养物等， 须经提取纯化才能作包被用。如 HBsAg 可以从携带者的血清中提取，
一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等（ 例如 AFP
从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为
质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠
杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性，因不少受检
者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从
天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV 抗
原含量极微。目前检测抗 HCV ELISA 中所用包被抗原大多为根据HCV 的基因克隆表达而制备的重组抗
原。在传染病诊断中，不少重组抗原如HBsAg、HBe Ag 和HIV 抗原等均在ELISA 中取得应用。合成多肽
抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一
个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被
一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地
结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含
有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另
外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他
抗体的漏检。
3.1.4 包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。
如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才
能用于 ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和
Sephadex 凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的 IgG 已可用于包被，高度纯化的IgG 性质不稳定。如需
用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性
IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理， 一般可将腹水作适当
稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，
在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
3.1.5 包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH 等应根据试验的特点和材料的性质而选
定。抗体和蛋白质抗原一般采用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2 的磷酸盐缓冲液及pH7~8
的Tris-HCL 缓冲液作为稀释液的。通常在 ELISA 板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃
中保温2 小时被认为具有同等的包被效果。包被的zui适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每
批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-2 0ug/ml。
3.1.6 封闭
封闭 （blocking）是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓
度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而
排斥在ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。zui常用的封闭剂是0.05%-0.5%
的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其
zui大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由
于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。
封闭是否必要，取决于 ELISA 的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不
当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤*，不经
封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在
固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的（见2.2.2）。包被好
的E LISA 板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月。
3.2 结合物
结合物即酶标记的抗体（或抗原），是 ELISA 中zui关键的试剂。良好的结合物应该是既保有酶的催化
活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。结合物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在结
合试剂中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外，结合物尚要有良
好的稳定性。
3.2.1 酶
用于 ELISA 的酶应符合以下要求：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，
价格不贵，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。在受检标本中不存在相同的酶。
另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。
在 ELISA 中，常用的酶为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（alkaline
phosohatase, AP）。在少数商品ELISA 试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。
国产 ELISA 试剂一般都用HRP 制备结合物。HRP 是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，
是一种复合酶，由主酶（ 酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。主酶无色糖蛋白
在275nm 波长处有zui高吸收峰，辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm 波长处有zui高吸收峰。HRP 的纯
度用RZ（Reinheit Zahl，德文，意为纯度数）表示，是403nm 的吸光度与280nm 吸光度之比，高纯度的HRP
的RZ≥?.0。
HRP 除符合上述的ELISA 中标记酶的要求外，更有价格低廉和性质较稳定的特点。值得注意的是，在
选用酶制剂时，除其纯度RZ 外，更应注意酶的活力。高纯度的酶如保存不当，活力也会降低。酶制剂的
活力以所含的酶活力单位表示，可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验。
国外很多 ELISA 试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶。常用的AP 有两个来源，分别从大肠杆菌和
小牛肠膜中提取。不同来源的酶生化特性特性略不相同，从大肠杆菌中提取的 AP 分子量为80000，酶作
用的pH 为8.0；用小牛肠膜中提取的AP 分子量为10 0000，zui适pH 为9.6。在ELISA 中，AP 系统
的敏感度一般高于HRP 系统，空白值也较低，但AP 价格昂贵，制备结合物所得率也较 HRP 低。
3.2.2 抗原和抗体
制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的 IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。用亲和
层析纯的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。
如用F（ab'）2 进行标记，则更可避免标本中RF 的干扰。在ELISA 中用酶标抗原的模式不多，总的要求是
抗原必须是高纯度的。
3.2.3 结合物的制备
酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。
（ 1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性
磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物
中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA 中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优
点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，
抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中， 先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，
再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶
与蛋白质是以1:1 的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有
效率较一步法低。
（ 2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，
过碘酸钠将HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成 Schiff 氏碱而结合。酶标
记物按克分子比例联结，其*比例为：酶/抗体=1-2/1 。此法简便有效，一般认为是HRP zui可取的标记
方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不
影响 ELISA 中zui后的酶活性测定，因经过*洗涤，游离酶可被除去，并不影响zui终的显色。但游离的抗
体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的
酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的
方法均可应用。硫酸铵盐析法zui为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相
当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，液相
层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得*的分离效果，但
费用较贵。
结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又
可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。zui适的
工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的*灵敏度，达到zui合适
的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作
试验时，能得到阳性反应的zui高稀释度。例如某一 HRP：抗人IgG 制剂标明的工作浓度为1:5000，表示
该制剂经1:5000 稀释后，在与人 IgG 包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA
检测中，酶标抗体的zui适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、
反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的zui大稀释度作为
试剂盒中的工作浓度。
3.2.4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干
燥后可在普通冰箱中保存一年左右， 但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结
合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的 ELISA 试剂盒中
的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在
较*的 ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6 个
月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防
腐剂（HRP 结合物加硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
3.2.5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲
液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如 1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入
具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20， 0.05%的浓度较为适宜。在间接测定
抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
3.3 酶的底物
3.3.1 HRP 的底物
HRP 催化过氧化物的氧化反应，代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。在ELISA 中，DH2 一般为无色化合物，经酶作用后成为有
色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺（O- phenylenediamine, OPD）、四甲基联苯胺
（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB）和ABTS[2,2'-azino-di-（3- ethylbenziazobine sulfonate-6）]。
OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm 处有zui高吸收峰，灵敏度高，比色方便，
是HRP 结合物zui常用的底物。OPD 本身难溶于水，OPD·2HCL 为水溶性。曾有报道OPD 有致异变性，
操作时应予注意。OPD 见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。在试剂
盒中，OPD 和H 2O2 一般分成二组分，OPD 可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使
用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液，使用时用蒸馏水稀释。*的ELISA
试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2 的应用液,只需加入OPD 后即可作为底物应用液。
TMB 经HRP 作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2
溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 又有无致癌性等优点，因此在ELISA 中应用日趋
广泛。酶反应用HCL 或H 2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，zui适吸收波长为
405nm。
ABTS 虽不如OPD 和TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
另一种 HRP 的底物为3-（4-羟基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，经HRP 作用后，产
物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA 的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP 对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物（urea peroxide）。H2O2
应用zui多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2 方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏
水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1 年。
3.3.2 AP 的底物
AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP）作为底物，可制成片剂，使
用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm 波长处有吸收峰。用Na OH 终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
AP 也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比
色法。
3.4 洗涤液
在板式ELISA 中，常用的稀释液为含0.05%吐温20 磷酸缓冲盐水。
3.5 酶反应终止液
常用的 HRP 反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的zui终体积而异，在板式ELISA 中一般采用
2mol/L。
3.6 阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品（positive control）和阴性对照品（negative control）是检验试验有效性的控制品，同时也作为判
断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为
标本的测定，对照品也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA 模式中可产生不同程度的本底。由于
大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆（recalcified human plasma）为原料，即在
血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品
须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg 检测的阴性对照品中不可含HBsAg，抗HBs 也是
阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量在试剂说明
书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中
受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg 的ELISA 试剂盒检测敏感度约为 0.5ng/ml，阳性对照
品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
3.7 参考标准品
定量测定的 ELISA 试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，
应包括覆盖可检测范围的4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。－

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