动物外周血 NK 细胞分离液实验方法
【产品规格】
2×200ml/Kit
【产品组成】
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
| 名称 | 产品编号 | 规格 |
A | 试剂 B |
| 200ml |
B | 试剂 D |
| 200ml |
C | 样本稀释液（赠品） | 2010C1119 | 200ml |
D | 清洗液（赠品） | 2010X1118 | 200ml |
E | 说明书 |
| 1 份 |
【实验前准备】
A． 适用仪器：zui大离心力可达 1200g 的水平转子离心机
B． 耗材：
| 产品名称 | 产品货号 | 产地 |
| 15ml 离心管散装 | 339650 | 美国 NUNC |
| 15ml 离心管架装 | 339651 | 美国 NUNC |
| 50ml 离心管散装 | 339652 | 美国 NUNC |
| 50ml 离心管架装 | 339653 | 美国 NUNC |
| 无菌胶头滴管或塑料滴管 |
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【检验方法】 |
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全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
首先取抗凝血按体积比 1:1 的比例加样本稀释液（产品编号：2010C1119）混匀，根据
稀释后的样本量大小，分以下两种情况：
情况 A：稀释后的血液样本量小于 5ml 时，实验方法如下：
1.取一支 15ml 离心管，依次小心加入试剂 B 3ml、试剂 D 2ml，制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。（稀释后的血液样本量小于 3ml 时，试剂 B 和试剂 D 用量分别为 2ml 和1ml。）
2.用吸管小心吸取稀释后的血液样本加于分离液液面上，400-500g，离心 20-30min（注：根据血液样本量确定离心条件，血液样本量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到*分离效果）。
3.离心后，此时离心管中由上至下分为五层。*层为血浆层。第二层为试剂 D 层。第三层为环状乳白色目的细胞层。第四层为试剂 B 层。第五层为红细胞层。
4.用吸管小心吸取第二层试剂 D 层和第三层环状乳白色目的细胞层到另一 15ml 离心管中，往所得离心管中加入 10ml 清洗液（产品编号：2010X1118），混匀细胞。
5.250g，离心 10min。
6.弃上清。
7.用吸管以 5ml 清洗液（产品编号：2010X1118）重悬所得细胞。
8.250g，离心 10min。
9.重复 6、7、8，弃上清后以 0.5ml 后续实验所需相应液体重悬细胞。
10.差异贴壁法纯化细胞
（1）用 NK 细胞无血清培养基（产品编号：CNK2015）或 NK 细胞*培养基（产品编号：HCNK2015）以 1.5-3×106 个/ml 的密度重悬细胞，将细胞铺于一次性细胞板或细胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培养箱中进行贴壁培养。
（2）2-4 小时内贴壁的为巨噬细胞前体（俗称为单核细胞）。
（3）10-24 小时内贴壁的单个核细胞为内皮、内皮祖细胞、干细胞。（4）不贴壁的为淋巴细胞。
注：
a.无血清培养基中不含任何动物成分，为得到更佳培养效果可添加 10%自体血浆或2-8%经灏洋筛选的胎牛血清。
b.*培养基中含 2-20%胎牛血清（血清具体含量由所培养的目的细胞而定）。
c.由于每种细胞的贴壁时间存在差异可将所得细胞分开已达简单的纯化目的，此法成本相对较低。如需获得高纯度目的细胞则需在使用分离液后选用免疫磁珠阳性或阴性分选。
情况 B：稀释后的血液样本量大于等于 5ml 时，实验方法如下：
1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂 B、试剂 D（体积比为 5:3，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面，各液面分层一定要清晰。
2.将经稀释后的血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（zui大离心力可至 1000g），离心 20-30min。（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越多，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需客户自行摸索，以达到*分离效果。加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。
3. 剩余步骤同“情况 A”中步骤 3 至步骤 10。
【注意事项】
1.全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得*的实验结果，在取血 2h 内进行实验，血液存放时间越长，细胞分离效果越差。血液放置超过 6h 后分离效果更差甚至不能达到分离目的。
2.本实验不要使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。
3.吸取过多的目的细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。
4.吸取过多的目的细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。
5.如所实验后细胞得率或活性过低，请天津灏洋以寻求帮助，具体详见下方生产企业信息。
【储存条件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启
封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
【参考值（参考范围）】
本实验 NK 细胞提取率大于 80%。
下表为成年人外周血中各种细胞的数量及比例，用户可适当进行参考。
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| 红细胞 |
| 白细胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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含量（个/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒细胞 | 淋巴细胞 | 单核细胞 | （1.0-3.0）×1011 | |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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A.流式细胞技术
B.免疫组化技术
C.原位杂交技术
D.PCR 技术
【可能存在的问题及解决方法】
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
出现情况 | 出现原因 | 建议解决方案 | |
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层 | 转速过小或离心时间过短 | 适当增减转速 | |
离心后目的细胞存在于分离液中 | 转速过大或离心时间过长 | ||
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离心后白环层弥散 | 细胞密度过大 | 调整细胞密度 | |
离心后白环层太浅或看不见 | 细胞密度过小 | ||
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2.本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
3.本分离液依照标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不*的情况，可以适当加大离心转速。
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到*分离效果，
离心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。
