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导言

近几年来，3D（three dimensional）细胞培养系统开始成为生物学研究新的研究方法。使用3D系统培养系统能更好的模拟生物体内的真实生理环境，而2D（传统的贴壁培养）细胞培养系统不能有效的模拟细胞在生物体内的生理环境。3D细胞技术有很多种方法，使用多细胞形成的细胞团是其中主要的研究应用之一。细胞团是微小的细胞聚集簇，可以用来研究3D情况下向外生长的情况（细胞出芽）。

一.实验原理

目前有几种方法可以用来生成细胞团。 所有方法的原理都是防止细胞贴壁，并且创造环境增强临近细胞间的细胞外基质的粘附。这里我们提供的是一个液体胶的形式来形成细胞团。这是一种形成细胞团的非常简单的方法，有如下的优势：

1）可以形成单个细胞团，并且易于用显微镜观测；

2）易于换液，可以进行长时间的培养；

3）这个方法操作简单，不需要额外的设备就能完成。

简单来讲就是先在多孔板底部加入琼脂糖，之后再加入细胞悬液。加入琼脂糖不仅仅是提供了个疏水表面，细胞不会粘附，又提供了一个凹液面，细胞可以聚集在凹孔中，加大了细胞和细胞之间接触的几率，增强了细胞之间的粘附。

二.实验材料

96孔板，平底（Corning 3370）

血管生成载玻片（德国ibidi，81506）

1.5%琼脂糖（Sigma，A9539，使用PBS或者超纯水配置）

胰酶

Matrigel

细胞培养基

三.成团实验步骤

1）96孔板预处理

• 配置1.5%琼脂糖，保持配好的琼脂糖为液体状态
• 96孔板每孔添加50μl配置好的1.5%琼脂糖，室温静置20分钟，待琼脂糖冷却固化。50μl琼脂糖能刚好覆盖96孔板单孔的底部，并且形成凹液面。
• 在96孔板的孔间加入无菌PBS，保证实验的湿度

2.细胞成团

• 按照日常方法准备细胞悬液
• 根据试验设计确定单孔需加入的细胞个数，本例中，每孔加入500个细胞
• 加入50-100μl的稀释好的细胞悬液，保证每孔总液体体积（包括琼脂糖）不超过200μl，每孔细胞数500个
• 培养箱中培养
• 每天都要换液，注意在细胞成团过程中不能剧烈晃动培养板
• 可以用相差显微镜观察细胞成团情况（图一）。

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                  图一：不同细胞系的成团过程（每孔500个细胞），比例尺 200μm。

四.出芽实验及分析

实验步骤：

1. 准备基质胶

• 实验前一天将Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使胶能过第二天缓慢融化。（注意：同样要准备一些4。C预冷的枪头用于吸取Matrigel）
• 开始实验前，将Matrigel始终保持放在冰盒中。
• 打开灭菌包装，取出ibidi血光生成载玻片 µ-Slide Angiogenesis。
• 每孔中加入10μl Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。

2.凝胶 

• 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
• 准备一个10cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。
• 将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。
• 将整个培养皿放入培养箱中，静置30分钟左右，等待胶凝结。

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3.细胞出芽实验及图像分析

• 将形成的细胞团吸出，置于凝固的胶平面上
• 培养并使用显微镜采集出芽图像
• 采用图像分析软件采集细胞团面积，出芽覆盖面积，出芽个数以及总出芽长度等数据。