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封闭
在转膜之后，也就是抗体孵育之前，需要对膜进行封闭。封闭是为了使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有BSA，脱脂奶粉，血清等，一般用的是脱脂奶粉。脱脂奶粉有些特殊情况是不适用的 ，脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用；不能用于磷酸化抗体对蛋白磷酸化的检测；不能用于碱性磷酸酶（AP）显示方法。
抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。
对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。 无论你如何提高自己的转膜技术，和低效之间往往只有数倍的差异， 而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价 不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的zui大化。
一抗：*抗体能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白，包括单克隆抗体和多克隆抗体；二抗：第二抗体能和一抗结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。一般二抗都会偶联可以检测的标记（如荧光、放射性、化学发光或显色基团），用来检测一抗；如果一抗本身偶联有这些标记，则不需要二抗，就是所谓的直接WB。
那么如何正确的来选择二抗呢？*根据一抗的种属来源选择二抗；第二根据一抗的类型选择二抗，根据单体数量和重链分类，将抗体分为IgA，IgD，IgE，IgG，IgM五类。其中又可分为几个亚型：IgA1-2，IgG1a，2a，2b，3，IgM1-2。
显色
酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent 和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高——随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。zui为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶 β-Galactosidase 。
常见问题分析：
1.曝光后背景过高且不均匀
封闭不充分：延长封闭时间，更换合适的封闭剂；一抗浓度过高：增加一抗稀释倍数；抗体孵育温度过高：4℃孵育；二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应：设置二抗对照（不加一抗），降低二抗浓度。
洗膜不充分：增加洗膜次数
2.没有阳性条带或很弱
一抗、二抗不匹配：订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物，可通过设置内参验证二级系统的有效性； 更换更好的抗体；一抗，二抗浓度低：增加抗体浓度，延长孵育时间封闭剂与一抗有交叉反应：封闭时使用温和的去污剂，更换封闭剂样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过少，设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或是靶蛋白含量太低，后者可增加样本上样量；转膜不充分还洗膜过度：使用丽春红S检测转膜效果，PVDF膜需浸透，正确的转膜操作，勿过度洗膜；曝光时间过短：延长曝光时间，更换更灵敏的发光液
3.背景有白色/黑色斑
转膜时有气泡或抗体分布不均：尽量除去气泡，抗体孵育时保持摇动；封闭剂溶解不充分有颗粒状
FAT细胞 FAT细胞株运输：冻存的细胞干冰运输，复苏的细胞冰袋运输。冬季我们会选择全血清包被细胞运输，运输途中细胞处于休眠状态，避免天气过冷导致的细胞死亡。
FAT细胞 FAT细胞株在运输、转移过程中，请勿打开自封袋；拿放细胞时请持瓶体，切勿在非无菌环境中碰触、拧动瓶口封口膜位置
进入生物安全柜前，打开自封袋拿出培养瓶，喷上酒精放进操作台(不建议使用酒精棉球擦拭)，撕开封口膜后，用酒精灯外焰对瓶口烧灼一圈(3秒左右)
细胞冻存如下：
1．细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。
2．计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。
3．冻存液：先用培养液9分＋DMSO 1分(或甘油)配成10％的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。
4．分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。
5．封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火焰封闭安剖口后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把安剖缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存日期，以便日后查找。
竖立培养瓶，拧开瓶盖(如是贴壁细胞，请用真空泵或吸管移除原配培养基，切勿让瓶口处的液体回流进瓶内)
更换为含10%-20%血清的*培养基，严格按照无菌操作要求继续培养。
