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α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性检测试剂盒说明书

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

货号：100T/48S

产品内容：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

微量法

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 2.5mL 双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

标准液：液体 1mL×1 支，4℃保存，5μmol/mL 对硝基苯酚溶液。

产品说明：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL

对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的 D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

α-GAL 分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约 0.2g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟， 取上清，置冰上待测。

3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL.

二、测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂）：

充分混匀， 400nm 处测定吸光值 A，计算ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。三、α-GAL 活性计算：

根据标准管的吸光度（x，减去浓度为 0 的标准管 OD 值）和浓度（y，nmol/mL）建立标准曲线，将△A 带入标准曲线中，计算样品生成的产物量（nmol/mL）。

1.按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol  对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2.按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g  组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/h /g 鲜重)＝(y×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=14×y ÷W

3.按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1  万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反总)÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.028×y

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.07mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数， 500 万；T：反应时间，0.5h。

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