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BC4480-50T/48S 顺乌头酸酶活性检测试剂盒 三羧酸
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- BC4480-50T/48S
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北京索莱宝科技有限公司
（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. ）是一家从事生物学试剂及试剂盒的高科技生物企业。
总部位于北京，并在设有经销或代理机构。产品因可靠而稳定的质量和较为完善的售后服务确立了“Solarbio”良好的品牌形象。公司秉承“以客户为中心、以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念，拥有专业的研发和质量检测团队以及的仓储和物流系统。“Solarbio”已经得到科研工作者的认可，成为广大经销商推崇的。
公司拥有一批专业的研发人员，我们专注于生物产品的不断完善和创新。产品覆盖面广，品质可靠。先后开发了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物医学等领域的多种试剂及试剂盒。同时，索莱宝公司提供各种常规生化试剂，库存常备产品多达10000多种，可随时为广大科研工作者提供各类专业试剂。在质量方面，索莱宝谨记公司信念：质量高于一切。所有研发的产品都设有严谨的生产流程，科学的质量检测方法和成熟的质量检测程序，我们恪守对每一位用户的承诺：用专业的态度做专业的品牌。同时，公司组建了一支专业的技术服务队伍，能够为科研工作者提供专业的技术服务。每一位购买索莱宝产品的用户都能够得到专业的咨询和完善的售后服务。
索莱宝公司坚持与接轨，注重和企业的合作与交流，并提供产品代理、市场咨询等多项服务。公司将一如既往与世界更多合作，不断为广大生物科研工作者提供更优质的产品和服务。公司理念：“为科研服务，为生命尽责”。一个人能够走多远，取决于与谁同行。索莱宝公司期待与各同行精诚合作。
索莱宝诚招生物试剂研发人员，期待与广大同行精诚合作，为广大科研工作者提供优质的产品，高效的物流以及专业的售后服务。索莱宝感谢所有朋友的支持与帮助，您的支持是我们前进的动力和保障。让我们携手同行，共同创造美好的明天。
详细信息
顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC4480
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体80 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体35 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体0.6 mL×2支 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂三：易挥发试剂，使用后尽快拧紧盖子，密封后放入-20℃保存；
产品说明：
顺乌头酸酶（Aconitase, ACO）是细胞内一种重要的铁硫蛋白酶，主要存在于胞浆与线粒体中。ACO催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆反应，对维持三羧酸循环及乙醛酸循环的顺利进行起着重要作用。
顺乌头酸酶催化异柠檬酸生成顺乌头酸，顺乌头酸在240nm有特征吸收峰，通过检测顺乌头酸的产生速率来计算该酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、顺乌头酸酶的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
A、总顺乌头酸酶的提取
称取约0.1 g组织或收集500万个细胞（细菌），加入1mL试剂一与10μL试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。将匀浆置于冰上超声波破碎（功率300W，超声3秒，间隔9秒，重复15次），4℃，11000×g离心15min，取上清置于冰上待测（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度Cpr1）。用于测定总顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4 -10倍后检测）。
B、胞浆与线粒体顺乌头酸酶的提取
(1) 称取约0.3 g组织或收集1500万个细胞，加入1.5mL试剂一与15μL试剂三，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
(2) 4℃，600×g离心5min。（若以蛋白浓度计算，则需留出足够量来测定蛋白浓度Cpr2）
(3) 将上清液移至另一离心管中，4℃，11000×g离心15min。
(4) 上清液即胞浆提取物，用于测定胞浆中的顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4-10倍后检测）。
(5) 在沉淀中加入600μL试剂二与6μL试剂三，置于冰上超声波破碎（功率300W，超声3秒，间隔9秒，重复15次），4℃，5000×g离心2min，取上清置于冰上待测。用于测定线粒体中顺乌头酸酶活性（建议将样本用蒸馏水稀释4-10倍后检测）。
注意：根据实验需要选择性提取细胞总顺乌头酸酶、胞浆乌头酸酶或线粒体乌头酸酶。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至240nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定
（1） 将试剂四25℃预热15 min以上；
（2） 在1mL石英比色皿中分别加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
试剂四 | 900 |
样本 | 100 |
加入样本即开始计时，立即混匀，于240nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于25℃水浴锅或恒温培养箱中反应5min，迅速取出比色皿并擦干，记录5min10s时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 | |
三、顺乌头酸酶活性的计算
1、总顺乌头酸酶活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样×Cpr1) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr1×N
（2） 按样本质量计算
酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样÷V提取×W）÷T×N=561.11×ΔA÷W×N
（3） 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10 6]÷(V样÷V提取×细胞数量(万个))÷T×N
=561.11×ΔA÷细胞数量(万个)×N
V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：样本总体积，1.01mL；T：反应时间，5min；Cpr1：样本蛋白质浓度，mg/mL；106：单位换算系数，1mmol=1×106nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。
2、胞浆顺乌头酸酶活性计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样×Cpr2) ÷T×N=555.55×ΔA÷Cpr2×N
（2） 按样本质量计算
酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/g 质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样÷V提取×W）÷T×N=841.67×ΔA÷W×N
（3） 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷（V样÷V提取×细胞数量（万个））÷T×N
=841.67×ΔA÷细胞数量（万个）×N
V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：胞浆样本总体积，1.515mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；106：单位换算系数，1mmol=1×106nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。
3、线粒体顺乌头酸酶活性计算：
（1） 按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/mg prot)= [ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样×Cpr2) ÷T×N= 555.55×ΔA÷Cpr2×N
（2）按样本质量计算
酶活定义：每g组织在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/g质量)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷(V样÷V样总×W）÷T×N=336.67×ΔA÷W×N
（3） 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟净生产1nmol顺乌头酸定义为一个酶活力单位。
ACO酶活(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×106]÷（V样÷V样总×细胞数量（万个））÷T×N
=336.67×ΔA÷细胞数量（万个）×N
V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：顺乌头酸消光系数，3.6L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：线粒体样本总体积，0.606mL；T：反应时间，5min；Cpr2：样本蛋白质浓度，mg/mL；106：单位换算系数，1mmol=1×106nmol；N：稀释倍数；W：样本质量，g。
注意事项：
1、 A大于1时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，并在计算时乘以相应的稀释倍数。
2、 当ΔA小于0.01时，可适当延长反应时间，并在计算时将实际反应时间（T）带入计算公式。
3、 测定蛋白浓度时，由于试剂一本身含有蛋白（约1 mg/mL），所以测定时需要扣除此部分蛋白。
实验实例：
1. 取0.1g黑麦草样本，加入1mL试剂一与10μL试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释4倍，测得ΔA=A2-A1=0.589-0.571=0.018，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：
ACO酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=403.999 U/g 质量。
2. 取0.1g兔子肾脏样本，加入1mL试剂一与10μL试剂三进行总顺乌头酸酶的提取，取上清稀释8倍，测得ΔA=A2-A1=0.414-0.383=0.031，按样本质量计算总顺乌头酸酶的酶活得：
ACO酶活(U/g 质量)=561.11×ΔA÷W×N=1391.553 U/g 质量。
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