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BC5420-50T/48S α-酮戊二酸含量检测试剂盒 三羧酸
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- BC5420-50T/48S
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北京索莱宝科技有限公司
（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. ）是一家从事生物学试剂及试剂盒的高科技生物企业。
总部位于北京，并在设有经销或代理机构。产品因可靠而稳定的质量和较为完善的售后服务确立了“Solarbio”良好的品牌形象。公司秉承“以客户为中心、以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念，拥有专业的研发和质量检测团队以及的仓储和物流系统。“Solarbio”已经得到科研工作者的认可，成为广大经销商推崇的。
公司拥有一批专业的研发人员，我们专注于生物产品的不断完善和创新。产品覆盖面广，品质可靠。先后开发了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物医学等领域的多种试剂及试剂盒。同时，索莱宝公司提供各种常规生化试剂，库存常备产品多达10000多种，可随时为广大科研工作者提供各类专业试剂。在质量方面，索莱宝谨记公司信念：质量高于一切。所有研发的产品都设有严谨的生产流程，科学的质量检测方法和成熟的质量检测程序，我们恪守对每一位用户的承诺：用专业的态度做专业的品牌。同时，公司组建了一支专业的技术服务队伍，能够为科研工作者提供专业的技术服务。每一位购买索莱宝产品的用户都能够得到专业的咨询和完善的售后服务。
索莱宝公司坚持与接轨，注重和企业的合作与交流，并提供产品代理、市场咨询等多项服务。公司将一如既往与世界更多合作，不断为广大生物科研工作者提供更优质的产品和服务。公司理念：“为科研服务，为生命尽责”。一个人能够走多远，取决于与谁同行。索莱宝公司期待与各同行精诚合作。
索莱宝诚招生物试剂研发人员，期待与广大同行精诚合作，为广大科研工作者提供优质的产品，高效的物流以及专业的售后服务。索莱宝感谢所有朋友的支持与帮助，您的支持是我们前进的动力和保障。让我们携手同行，共同创造美好的明天。
详细信息
α-酮戊二酸（α-KG）含量检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC5420
规格：50T/48S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
规格 | 保存条件 | |
提取液一 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体9 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体40 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体4 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂三：临用前加入3.34mL蒸馏水充分溶解。未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。
2、 试剂四：临用前加入0.5mL蒸馏水充分溶解。未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。
3、 标准品：临用前加入0.856mL蒸馏水充分溶解，配制成80μmol/mL α-酮戊二酸标准溶液，2-8℃可保存4周。
4、 试剂四工作液：临用前根据样本量按试剂四：蒸馏水=0.1mL：0.4mL（共0.5mL，10T）的比例配制，现用现配。
5、 400nmol/mL标准溶液配制：实验前取50μL的80μmol/mL标准溶液，加入950μL蒸馏水充分混合配制成4μmol/mL标准溶液。再取100μL 4μmol/mL标准溶液和900μL蒸馏水混合配制成0.4 μmol/mL（400nmol/mL）标准溶液备用。
产品说明：
α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点。α-酮戊二酸作为一种短链羧酸分子，是谷*酰胺、谷*酸等多种重要的氨基酸的前体，不仅直接参与供能，还参与细胞内多种化学反应，具有多种生理作用。
GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH，生成谷*酸和NAD+，引起340nm吸光度下降。通过测定NADH的变化，计算α-酮戊二酸含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/金属浴/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。
操作步骤：
一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
2. 细胞：按照细胞数量（106个）：提取液一体积（mL）为5~1：1的比例（建议5百万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。
3. 液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。
注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。
2、 加样表：（在1mL比色皿中加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 300 | - | - |
标准品 | - | 300 | - |
蒸馏水 | - | - | 300 |
试剂一 | 550 | 550 | 550 |
试剂二 | 50 | 50 | 50 |
试剂三 | 50 | 50 | 50 |
37℃预热5min（建议使用水浴锅或金属浴预热） | |||
试剂四工作液 | 50 | 50 | 50 |
加入试剂四工作液后立即充分混匀，于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃环境中反应5min，拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，记录340nm下20s时吸光值A1和5mi20s的吸光值A2。计算ΔA测定=A1测定-A2测定，ΔA标准=A1标准-A2标准，ΔA空白=A1空白-A2空白。空白管和标准管只需测定1-2次。 | |||
三、α-酮戊二酸（α-KG）含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
α-KG含量(nmol/mg prot) = C标准× (ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)×V样÷ (Cpr×V样)×F
= 400×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)÷Cpr×F
(2) 按样本质量计算
α-KG含量(nmol/g 质量) = C标准×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白) × (V上清+V提取液二)÷ (W×V上清÷V提取液一)×F
= 475×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)÷W×F
(3) 按细菌或细胞数目计算
α-KG含量(nmol/106 cell) = C标准×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)×(V上清+V提取液二)÷(N×V上清÷V提取液一)×F
= 475×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)÷N×F
(4) 按液体体积计算
α-KG含量(nmol/mL) = C标准×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)×(V上清+V提取液二)÷[V液体×V上清÷(V液体+V提取液一)]×F
= 5225×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)×F
C标准：α-酮戊二酸标准溶液浓度，400 nmol/mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.3mL；V上清：提取时上清的体积，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的体积，0.15mL；V提取液一：加入提取液一的体积，1mL；V液体：液体样本体积，0.1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数目，以106计；F：样本稀释倍数。
注意事项：
1. 如果样本A1测定＜A1空白或∆A测定大于0.8，可以用蒸馏水对样本进行稀释或者缩短第二步37℃反应时间；如果∆A测定小于0.01，可以加大样本量或者延长第二步37℃反应时间。最终计算时同步修改计算公式。
2. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。
3. 温度对该实验影响较大，务必保持反应温度在37℃。
实验实例：
1、 称取0.1066g小鼠肝脏组织进行样本处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A1测定-A2测定=1.201-1.175=0.026，ΔA标准=A1标准-A2标准=1.015-0.487=0.528，ΔA空白=A1空白-A2空白=1.080-1.074= 0.006。带入公式计算：
α-KG含量（nmol/g 质量）=475×(ΔA测定-ΔA空白) ÷ (ΔA标准-ΔA空白)÷W×F =170.72 nmol/g 质量
参考文献：
[1] Azmi N E, Ahmad M, Abdullah J, et al. Biosensor based on glutamate dehydrogenase immobilized in chitosan for the determination of ammonium in water samples[J]. Analytical Biochemistry, 2009, 388(1):28-32.
[2] Fei Ding, Qiannan Hu, Meiling Wang, et al. Knockout of SlSBPASE Suppresses Carbon Assimilation and Alters Nitrogen Metabolism in Tomato Plants. International Journal of Molecular Sciences. December 2018;(IF4.183)
[3] Lin Y, Nan J, Shen J, et al. Canagliflozin impairs blood reperfusion of ischaemic lower limb partially by inhibiting the retention and paracrine function of bone marrow derived mesenchymal stem cells[J]. EBioMedicine, 2020, 52: 102637
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