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原位杂交技术

武汉华联科生物技术有限公司

2017/4/24 11:08:30

导语

我们常说,科学家也是艺术家,在明确真理探索科学的道路上,往往会创造出很多美感的艺术作品。所以今天小编为大家介绍的就是能做出美美图的新技能。

先欣赏一下美美的实验结果图~

---Olson, B. D. and Downes, G. B.

 ---in situ Hybridization of wild type Drosophila embryos

接下来为大家介绍能做出这种美美图的新技能,原位杂交实验~

基本原理

简单点说就是碱基互补配对原则。*来讲的话,就是我们将外源核酸(也就是常说的分子探针)与组织、细胞上待检测的DNA或RNA进行配对,形成核酸杂交分子,再经过一定手段将这个杂交分子的位置显示出来。

实验技术的更新是很快的,在明确了该技术的可行性后,科学家进一步改进并进行分类,主要有以下几类:

荧光原位杂交技术:DNA分子原位杂交技术;在原技术手段上增加了荧光元素,技术手段较为*,易掌握,运用广泛,一会儿小编会着重介绍哦~毕竟,能够在我们自己的实验中运用上,才是我们的zui终目标嘛。

多彩色荧光原位杂交技术:显而易见,是荧光原位杂交的升级版,采用多个荧光来检测,目前的发展及运用也是较多的。

原位PCR:将原位杂交结合PCR技术发展起来的实验方法。说实话,了解的比较少,我就不班门弄斧了,呵呵。

基因组:该技术在我们的领域可能运用的毕竟少,主要是根据物种DNA同源性差异实现,在农作物等的杂交育种上运用较广,我就不详细介绍啦~

明确了以上的分类及原理后,接下来小编主要讲讲在我们的领域中运用较广的荧光原位杂交方法

结合示意图可以更好的理解哦

实验材料(重要的,基础材料不赘述)

1.4%多聚甲醛(1x PBS配置):固定剂

2.蛋白激酶K:使得靶核酸暴露,增加探针和靶核酸结合。

3.杂交缓冲溶液

实验步骤

取材:动物组织取材(小鼠采用心脏灌流法)后在4%的多聚甲醛中固定4小时左右, 1x PBS洗5次,每次30分钟,用25%蔗糖脱水过夜(均在4°进行)。样品做OTC冰冻切片,厚度16 mM,收集在载玻片上,冷冻于-20℃。

1. 原位杂交:

(1)取出玻片,在50℃预热15 min,放入原位杂交盒中,加入新鲜配制的4%多聚甲醛,室温固定30分钟,DEPC-PBS洗三次。用10 µg/ml的蛋白激酶K处理组织10~15 min,DEPC-PBS洗三次。

(2)4%多聚甲醛,室温固定15 min,用水洗一遍后,加入预杂交液置于65℃烘箱内。 4h后,回收预杂交液,加入含1-2 µg/ml探针的杂交液, 65℃过夜。

(3)次日,用65℃的2× SSC洗涤5 min, 2-3次。将载片转移至玻璃固定盒中65℃加入搅拌子搅拌15 min,加入RNaseA 0.2µg/ml, 37℃ 30 min。 65℃的1× SSC冲洗一次,再用0.2× SSC洗涤3次, 每次30 min。

(4)室温下,用含15%的羊血清封闭载片1h。滴加生物素化鼠抗地高辛,室温2h。 PBT洗涤3次,每次30 min。 用新鲜配制的碱性磷酸酶液洗涤3次,每次5 min。加入含有50 µg/ml的NBT和BCIP的碱性磷酸酶液孵育过夜。

(5)观察信号,如果信号足够强,用多聚甲醛停止试验,用甘油封片,采集图片。

来源:弗雷赛斯

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