单克隆分离是由单个细胞进行分裂、增殖，形成具有相同遗传性状的细胞群体。由于来源于同一个祖先细胞，扩增形成的细胞群还具有十分相近的形态特征和基本一致的生理、生化特性。
是建立稳定细胞系的重要环节，因而在现代生物技术和医药研发领域中应用广泛。构建稳定细胞系的常用方法有质粒转染法和病毒侵染法，两种方法都需要借助抗生素筛选，通过单细胞克隆分离最终获得表型稳定、遗传特性一致的细胞群。质粒转染法是通过转染试剂将质粒dna导入细胞，其中极少部分dna会整合到基因组，通过单细胞克隆分离和抗生素筛选，获得表达效率高、整合稳定的细胞群，最终构建成稳定细胞系；而病毒侵染法则是通过将携带目的片段的病毒，常用的如慢病毒，转导入细胞，再通过单细胞克隆和抗生素筛选，获得稳定细胞系。
单克隆分离方法：
a、制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。
b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞三种不同的稀释度。
c、按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d、每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e、37℃、7.5%CO2湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。
f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。
