Protein A(Protein A)ELISA试剂盒

 (用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

一、原理：

   本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗 Protein A 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 Protein A与单抗结合，加入生物素化的抗Protein A，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，后加终止液硫酸，在405nm处测OD值，Protein A浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Protein A浓度。

二、试剂盒组成（2-8℃保存）：具体组成部分看试剂盒内的说明书为准。

三、准备试剂与收集血样

 1、收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。血清、血浆、细胞培养上清可能需要稀释,请先做预实验,以确定稀释倍数。

2、标准品液配制：具体看以试剂盒内的说明书为准。

3、样品可以使用10×标本稀释液来稀释，此时PH 在7.2-8.5之间。蛋白浓度在1mg/ml以下。比如10倍稀释：（20ul样品＋160ul的蒸馏水+20ul的10×标本稀释液）

4、Protein A 样品如果含有Ig或Ig片段，需预处理：将装有Protein A 样品的EP管放入沸水中煮浴10 min；取出样品，冷却到室温；13000 g离心4 min；留取上清备用。

5、洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

 四、检测程序：

 1、加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。

 2、洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

  3、每孔加入蒸馏水和抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。

 4、洗板：同前。

 5、每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。

 6、洗板：同前。

 7、每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

 8、每孔加入100ul终止液混匀。

 9、30分钟内用酶标仪在405nm处测吸光值。

 五、结果计算与判断：

 1、所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。

 2、以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。

 3、根据样品OD值计算出相应Protein A含量，再乘上稀释倍数即可。软件可以向本公司邮件索取。

 六、试剂盒性能

   1、灵敏度：小的Protein A 检测浓度小于16pg/ml。

    2、特异性：可同时检测重组或天然的Protein A。不与其它细胞因子有交叉反应。

  3、重复性：板内、板间变异系数均小于10.6％。

 七、注意事项

 1、以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

  2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致出现误差及OD值错误地升高。

  3.   检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

  4.   试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

  5. 说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！

 6.   本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！