适用于中国区域CDV,CPV,CCV病毒诊断的配对单抗全新上市

                       武玉香

一，研究背景

犬瘟热是一种急性、传染性*的病毒病,在幼犬中本病的死亡率较任何其他传染病为高。犬瘟热也是水貂的一种传染病,又称貂瘟,死亡率很高,引起严重的经济损失。

犬瘟热病毒(Canine distemper virus)粒子呈现多形性,多数为球形,病毒粒子的直径为110~550nm,大多数在150~330nm之间,亦有畸形和长丝状的病毒粒子,病毒的基因组为不分节、非重叠的负链RNA,由15616个核苷酸组成,从它的3端到5'端依次为3’端前导序列、核衣壳基因、磷蛋白基因、基质膜蛋白基因、融合蛋白基因、附着或血凝蛋白基因和5端引导序列。病毒粒子中的主要蛋白质有核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)、融合蛋白白(fusion protein,F)、附着或血凝蛋白(attachment protein or hemagglutinin protein,H)。负链RNA被一个螺旋状衣壳包裹,主要由N组成,P和L也是核衣壳的成分。核衣壳呈螺旋状,总长度为1000nm,螺旋直径15~19nm,螺旋中心有5nm的孔,螺距5~6nm,核衣壳由囊膜包裹,其内部为M,厚约5nm,表面为H和F两个糖蛋白组成的纤突,纤突的长度为9nm。    本病毒在-10度可生存几个月,在-70℃或冻干条件下可长期存活;在0℃以上感染力迅速丧失。干燥的病毒在室温中尚稳定。病毒在pH3.0时不稳定,在pH4.5以上时尚稳定,pH7.0有利于病毒的保存。可见光容易将病毒灭活。对**敏感。0.1%甲醛或1%煤酚皂溶液在几小时内灭活病毒,病毒经甲醛灭活后仍能保留其抗原性。
     犬细小病毒( Canine parvovirus,CPV)于 1978 年同时从澳大利亚(Kely)、

加拿大( Thomson 等)患肠炎的病犬中分离获得,是继 1967 年 Binn 等从犬分离的第二种细小病毒,是继1967年Binn等从犬分离的第二种细小病毒,它与Binn早期从健康犬分离的犬极小病毒( Minute virus of canine,MVC)在致病性上显著不同,抗原性上也有明显差异。CPV可引起犬出血性腹泻和心肌炎,并使白细胞大量减少,在幼犬中的发病率和死亡率都很高,症状与猫泛白细胞减少症相似。而MVC的致病性迄今尚未明确,虽然某些犬群的抗体阳性率很高(达70%)。

本病虽发现时间不长,但在欧、美等一些商业性饲犬场,相继有流行和造成幼犬群损失的报道。除上述早报道的两个国家外,已相继在美国、英国、德国和法国发现,当前已成为犬的一种重要传染病,我国亦有本病的暴发流行,并已分离获得多株病毒,研究报道日趋增多,并发现它在抗原性上与猫泛白细胞减少症病毒有密切关系。

犬冠状病毒( Canine coronavirus,CCV)引起犬的胃肠炎,1971年*在美国发生腹泻军犬的粪便中电镜检出该病毒。犬冠状病毒性腹泻原为比较缓和的疾病,病犬大多能够康复,但因经常与犬细小病毒等发生混合感染,而引起严重乃至致死性转归的疾病。近年来世界上许多国家和地区都有本病流行的报道,我国亦已多次发现本病暴发。

犬冠状病毒具有冠状病毒的一般形态特征,呈圆形或椭圆形,长径80~120nm,宽径为75~80nm;有囊膜,囊膜表面有花瓣状纤突,长约20nm;核衣壳呈螺旋状。

 各种品种和年龄的犬都易感,但幼犬症状较重,潜伏期1~3天,常迅速蔓延全群。病犬精神萎顿、厌食、呕吐,随后排稀软带粘液的糊状粪便,灰白色或黄白色,常有恶臭,有时呈水样,橙色至绿色,含有血液。病犬迅速速脱水,消瘦,但体温常不明显升高,多数病例在7~10天内康复,某些幼犬可能呈严重症状,并因发热、脱水和衰竭而死。

二，目的意义

10多年来，中国的宠物市场越来越大，在宠物店，我们能看到琳琅满目的写着英文字母的诊断产品，可食用产品，治疗性用品，喜爱宠物的人们不计价钱的高低信赖进口的产品。即使是开发抗原诊断试纸产品的原材料--单克隆抗体，也是依赖进口，几年来芬兰HyTest，韩国金诺JBT 等品牌几乎如垄断性的占据了中国大部分市场，但是由于他们开发抗体用的免疫原都是分离的他们本国本土的病毒，正如技术背景所说，在不同国家，不同区域都可以分离获得多株病毒，变异程度随区域而改变。市场客户反馈的问题大多于某些株型出现漏检现象，灵敏度逊色于进口产品。本项目通过分离中国区域内不同株病毒，选择致病强的毒株作为免疫原，耗时3年多时间，肩负着沉重的社会责任感，致力于为中国市场提供自给自足的原材料，减弱进口的垄断，至此CDV,CPV,CCV病毒诊断的配对单抗全新上市，在灵敏度方面、货期的迅速程度、漏检控制等方面都做了全新的测试。

• 单抗质量鉴定

①免疫荧光鉴定

CDV:

1.Vero细胞铺96孔板一个，同时接毒，按照5%接毒，每孔接50ul。

   2.第3-5日病变。用0.01Mpbs洗三次后弃掉pbs，拍干。

   3.加入冷乙醇（-20℃存放）固定20分钟，放入-20℃后弃掉上清，不拍板。

4.pbs洗三次，弃上清，不用拍板，吸干水分。

5.加入一抗，按照0.1 mg/ml加入。37℃防置40分钟，pbs洗三次，吸干水分。

6.加入二抗（按1:40加入，pbs稀释）37 ℃防置40分钟。Pbs洗4次，吸干水分，不拍板，观察。

7.显微镜亮度：1.5亮度

②.注意：1.做不接毒的空白细胞对照。

         2.pbs洗要同一位点加入，要温柔。

         3.铺板同步接毒。

4.接毒后注意观察病变情况，出现60%左右的病变测免疫荧光。

图中显示37C7  36D9  7G5细胞株均表现了强荧光。

CPV:

从患病狗粪便中分离细小病毒，在F81细胞里体外增值，然后用几株单抗识别活病毒的荧光鉴定试验，可以看到，荧光信号特别强，也就是说这几株单抗识别野毒的能力特别强，特异性特别好。

CCV: 感染人的SARS病毒，未做免疫荧光鉴定。检测时注意个人防护。

②胶体金确认鉴定

所开发CDV检测卡用于测试病毒培养情况，表明病毒的分布在上清和细胞内均存在。

CDV单抗配对测试，*代为（5D4-8D1），胶体金条件： 5-6微克蛋白/ml金液，5D4 标记；8D1划线0.5-1mg/ml。经过配对比对，筛选出了更好的配对组合，37C7 标记；36D9划线0.5-1mg/ml。（37C7- 36D9 ）配对的灵敏度是其余组合的3-10倍。

CPV配对情况（7D6-5B10/5E2）；（4E10-5E2）；（5B10-4E10），可以用于配对的组合有4组，每一组的灵敏度达到了低检测限0.1微克/毫升病毒液。

【胶体金条件】： 5-6微克蛋白/ml金液，划线0.3-0.5mg/ml，5B10-4E10均可以用于划线和标记，推荐5B10包被，4E10标记。

CCV：
 

10份临床疑似感染样本，PCR鉴定S基因480pb结果与此*。

四、配套羊抗鼠与万能C反应蛋白； CDV、cpv纯化标准阳性抗原。

五、产品说明书附录

生产公司：山东绿都生物科技有限公司