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Rabbit Hypoxia Inducible Factor 1a elisa kit 兔低氧诱导因子 1a elisa kit
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- Rabbit Hypoxia Inducible Factor 1a elisa kit
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详细信息
兔低氧诱导因子 1a
标本：血清或血浆
使用说明书
产品编号：E04H0203
本试剂盒仅供科研使用，不得用于临床及诊断使用！
预 期 应 用
ELISA法定量检测人血清或者血浆中免低氧诱导因子
试 剂 组 成
| 名称 | 规格 | 数量 | 保存 |
| 包被平底微孔板 | 96孔 | 1可拆卸板 | 2 |
| 酶结合物 | 6毫升 | 1瓶 | 2 |
| 标准品 | 1毫升 | 6瓶 | 2 |
| 显色剂A | 6毫升 | 1瓶 | 2 |
| 显色剂B | 6毫升 | 1瓶 | 2 |
| 终止液 | 6毫升 | 1瓶 | 2 |
| 浓缩洗涤液（100倍稀释） | 10毫升 | 1瓶 | 2 |
| 使用说明书 | | 1份 | |
自备物品
1.酶标仪（尽量提前预热）
2.微量加液器、吸头
3.蒸馏水或去离子水以及滤纸
样本的采集及保存
一般的生物标本包括有：
血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等
一般为无菌操作，低温保存（
一．如果采集的实质器官则要求：
1、 器官实质不能太小
2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳
3、 同一病例装入同一容器，并做好标记
4、 应在0
5、 实质性器官的处理：
5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨
5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水，充分混匀
5.3、离心5000rmp x10min，去上清
5.4、
二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式
1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样
1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，
1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或
2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用，但是一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，的采集的时间时空腹采集；
3、尿液的采集方式基本和唾液一样的，即现采现用，但是一般隔夜尿不采集；
4、组织提取液如肺泡灌洗液等，采集后离心分离，800-1000rmp x 5min，取上清，
三．粪便以及天然孔排泄物：采集后一般现用PBS/生理盐水溶解，充分混匀，800-1000rmp x 5min分离，取上清，
四．活检组织一般进行穿刺检测，zui常见的就是肝活检，像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。
三、表达产物的检测
（一）真核表达产物
1、 细胞上清（分泌性蛋白）
1.2、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，
1.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmp x10min，吸取上清至另一10ml离心管中，10000rmp x10min，
2、 细胞裂解物（非分泌性蛋白）
2.1、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，然后用
2.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmp x10min，弃上清，沉淀移至另一10ml离心管中，
（二）原核（大肠杆菌表达系统）表达产物
1、表达上清（非融合性蛋白）
直接将培养物和上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，
2、菌体裂解物（融合性蛋白）
直接将培养物和上清吸出，10000rmp x10min，弃上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmp x10min，弃上清，DDW重悬沉淀，冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmp x10min，取上清，
注 意 事 项
1.试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。
2．加样：加样时，要控制加样速度，避免*孔与zui后一孔之见的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性；一般加样时间控制在10分钟内，如果样本数量过多，可使用多道移液器。
3.孵育：样品要在密闭的容器内进行孵育，严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。
4.洗涤：洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，同时要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响zui后的酶标仪读数。
5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。
6.建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。
7.建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。
操 作 步 骤
1. 取出试剂盒，于室温（20
2. 取出酶标板，按照标准品的次序分别加入100μl的标准品溶液于空白微孔中。
3. 空白微孔中加入100μl的样品，空白对照加入100μl的蒸馏水；
4. 在各孔中加入50μl的酶标记溶液；（不含空白对照孔）
5. 将酶标板用封口胶密封后，
6. 充分清洗酶标板3-5次，保持各孔有充足的水压；（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）
7. 酶标板洗涤后用吸水纸*拍干；
8. 各孔加入显色剂A、B液各50μl；（不含空白对照孔）
9. 20
10. 各孔加入50μl终止液，终止反应；
结 果 判 断
1. 30分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；
2. 百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，非特异管计数为NSB，则百分结合率计算公式如下：B/ B0=（B－NSB）/（ B0－NSB）×*
3. logit计算:各标准点或样品管的logit值计算公式如下:logit=ln（B/ B0）/（1－B/ B0）
4. 将标准品的OD均值与标准品0点的OD均相除，为标准点的百分结合率，在log-logit坐标纸上绘图。
5. Log-logit双对数标准曲线：坐标纸上横轴从左至右*个1-9表示为*个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9表示为第三个10进位。坐标纸纵轴为百分比（1-99），即各标准吸光值的百分结合率。取一条通过各点的直线。要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度，无须换算。
6. 人工处理：以标准浓度取log值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的B/B0为纵坐标在logit-log坐标纸上画出标准曲线（理想化时是一条直线）。根据待测样品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。如果使用普通坐标纸，查出的数值应取反对数才是zui后的浓度值。
7. 自动处理：使用logit-log或四参数数据处理模式，由电脑自动计算得出结果。
8. 敏感度：0.01ng/ml；
9. 图例
