M-MuLV Reverse Transcriptase反转录试剂
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详细信息
M-MuLV Reverse Transcriptase
产品货号：M2000
储存条件：-20℃
浓度：200 units/μl
组成 | M2000 |
M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl) | 20万U |
制品说明
本制品使用通过基因重组技术克隆表达的点突变型 RNase H 活性缺失的 M-MuLV 反转录酶 TRUEscript Hˉ RTase。野生型的 M-MuLV 包含的 RNase H 活性能够催化降解 DNA/RNA 杂合体中的 RNA， 因 此 在 cDNA First-Strand 的合成反应中可能会降解 RNA/DNA 杂合体中的模板 RNA。本酶 M-MuLV(RNase Hˉ)的 RNase H 活性缺失，与 M-MuLV 相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的 cDNA 合成以及高比例的全 长 cDNA 文库的构建等。
适用范围：First-Strand cDNA 合成。可用于低拷贝基因的检测。
特点：合成 cDNA 片段长度可达 12 kb。
First-Strand cDNA 合成(以 20 μl 反应体系为例)
1、加入
Components | Volume |
Total RNA/mRNA | 50 ng-5 μg/5-500 ng |
Oligo(dT)18(0.5 μg /μl)or | 1 μl |
Random Primer(0.1 μg/μl) or | 1 μl |
GSP(Gene Specific Primer) | 2 pmol |
dNTP Mixture (10 mM each) | 1 μl |
5× RT Buffer | 4 μl |
RNase Inhibitor(40 units/μl) | 0.5 μl |
TRUEscript Hˉ RTase | 0.8-1μl (见注意事项 4) |
RNase free H2O to final volume | 20 μl |
2、轻轻混匀
如用 Oligo(dT)18 或基因特异引物(GSP)，42℃孵育 30-50min。
如用 Random Primer，25℃孵育 10 min，42℃孵育 30-50 min。
3、65℃加热 15 min(或者 85℃加热 5 min)失活 TRUEscript Hˉ RTase。
RT-PCR
建议取 1/10-1/5 体积(2-4 μl)的反转录产物作为 PCR 模板。
建议 PCR 条件(以 50 μl 反应体系为例)
Components | Volume | Final Concentration |
cDNA Template | 2 μl | as required |
Forward Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
Reverse Primer (10 μM) | 1 μl | 0.2 μM each |
10×Taq Buffer (含 Mg2+) | 5 μl | 1× |
2.5 mM dNTPs | 4 μl | 0.2 mM |
Taq DNA Polymerase | 0.5 μl | 2.5 units |
ddH2O to final volume | 50 μl | Not applicable |
PCR 循环
注意事项
1.避免 RNase 污染。
2.为保证反转录成功建议使用高质量的 RNA 样品。
3.如果 RNA 模板 GC 含量丰富或者有复杂二级结构，可以先只加 RNA 模板、引物和和 RNase free H2O 混匀， 65℃变性 5 分钟，冰上冷却，短暂离心后加入其它成分继续下面的反转录步骤。
4.TRUEscript Hˉ RTase 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心后使用，并且避免吸头外壁沾附损失。可以每次按照 0.8μl使用，也不影响使用效果。
5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
6、本品仅用于实验研究。
