细菌转座子突变体文库构建介绍

转座子(transposon)是一类可以自主位移并插入宿主基因组中随机位点的移动遗传因子，这种转位特性使它可以直接或间接地造成基因重排，引起基因变异。

随着许多微生物基因组全序列的获得,人们对微生物关注和研究的热点已经从结构基因组学转移到功能基因组学，在大量的分子遗传研究方法中，转座子随机诱变技术因操作简便易行而备受关注。

该方法是将转座子引入细菌染色体中，随机插入诱变某些基因得到大量的突变株,从中筛选感兴趣表型的突变株，进而研究与该表型相关的被失活基因的功能。现在转座子突变技术已经成为微生物分子遗传学研究的有力工具之一，转座子及其衍生物作为插入突变原或分子标签已被广泛地应用于基因的分离和克隆当中,特别是某些具有随机转座特性的转座子,已成为发现新基因、克隆功能基因、发掘己知基因的新功能以及研究蛋白功能的有效工具。

构建细菌的转座子随机突变库是从基因组水平筛选毒力相关基因、生物被膜相关基因等与特定表型相关基因的一种重要手段。我们做过铜单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、幽门螺旋杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、变形链球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌等细菌的转座子突变体构建，具有丰富的构建经验，下面给大家简单介绍一下我们做过的转座子突变体文库构建大概过程，供相关科研工作者参考。

1.    菌株选择

一般可以做标准菌株也可以做自己筛选分离的特殊菌株。主要还是看我们想研究的客户目的。比如我们在土壤中或者血液中分离出来一种抗性非常强的菌株，那么我们也是可以对此菌株进行突变体文库构建，进一步去筛选相关耐药基因和耐药机制的。由于构建出来的突变体库数量多，因此此文库比较适合专门针对某种细菌研究的实验室进行构建研究。

2.    提前准备：

（1）菌株全基因组测序数据：为后续突变株插入位点验证分析提供数据参考；

（2）抗性分析：确定对哪些抗生素敏感，从而为载体构建时的抗生素选择提供参考。

3.    载体选择和构建

Tn917、Tn10 及 mariner 类家族转座元件是目前在芽孢杆菌中应用比较广泛的 3 类转座子，而且都已被改造并成功应用于变体库的构建及基因功能的研究中，特别是芽孢杆菌中的转座频率高，但各具有不同的转座特点，其中 mariner 类家族转座元件更具优势，表现出良好的应用前景。

转座子 Tn917 是一种链球菌 Tn3 类似转座子，被构建于温敏复制质粒载体如 pTV1[1]（图1）【5】、pTV1Ts及具有葡萄球菌复制子 pE194、pE194Ts 的衍生质粒上[8]。Tn917 长度为 5.4 kb，携带可诱导的红霉抗性基因，含有与 Tn3 家族转座子类似的末端重复序列，并且 Tn917 的转座酶与 Tn3 的转座酶有 80%的相似性。

转座子 Tn10 是继转座子 Tn917 之后，被应用于转座诱变的另一个很好的选择。Tn10 是一种鼠伤寒沙氏菌 Salmonella typhimurium 转座子。它是具有多种抗生素抗性标记质粒 R100.1 的一个组成部分，长度为 9300 bp，由两端长 1329 bp 的末端反向重复序列 IS10 及位于两端 IS10 之间的长 6700 bp 的四环素抗性基因组成。其中，四环素抗性基因 tetR 来自一种从噬菌体P22 中获得的 R 因子。Tn10 可在鼠伤寒沙菌及大肠杆菌染色体上发生不依赖寄主重组系统的转座，并且能够转座插入到沙氏菌染色体的多个不同位点上。Mariner 转座元件是一种  简单的真核转座子，与其他转座子相比，mariner 转座元件具有插入位点随机性高，以及与品种特定的寄主因素无关、可以在不同品种间水平转移的特点Mariner 及其类似转座元件被称作 MLEs（Mariner-like elements）Mariner 家族转座元件  活跃、研究  成熟的两种转座元件是 Himar1 和 Mos1 转座元件。Himar1 转座元件是从西方角蝇中分离得到的[4]，是在细菌诱变中应用  广泛的 mariner 家族转座子。Mos1 转座元件来自黑腹果蝇，是 mariner 家族在真核生物应用中  高效的转座元件。

4.    转座子载体转化和突变体库构建和表型筛选鉴定

5.    技术应用

转座子及其衍生物作为插入突变工具或分子标签已被广泛地应用于基因的分离和克隆之中，特别是某些具有随机转座特性的转座子，已成为发现新基因、克隆功能基因、发掘已知基因的功能以及研究蛋白功能的有效工具。

6、参考文献

【1】Rhodes K A ,  Ma M C , María A.Rendón, et al. Neisseria genes required for persistence identified via in vivo screening of a transposon mutant library[J]. PLoS pathogens, 2022, 18(5):e1010497.

【2】Poulsen B E ,  Rui Y ,  Clatworthy A E , et al. Defining the core essential genome of Pseudomonas aeruginosa[J]. Cold Spring Harbor Laboratory, 2018(20).

【3】Rajagopal M ,  Martin M J ,  Santiago M , et al. Multidrug Intrinsic Resistance Factors in Staphylococcus aureus Identified by Profiling Fitness within High-Diversity Transposon Libraries[J]. mBio, 2016, 7(4):e00950-16

【4】Mike L A ,  Stark A J ,  Forsyth V S , et al. A systematic analysis of hypermucoviscosity and capsule reveals distinct and overlapping genes that impact Klebsiella pneumoniae fitness[J]. PLoS Pathogens, 2021, 17(3):e1009376.

【5】马欣, 高学文. 转座子随机突变芽孢杆菌的研究进展[J]. 中国生物防治学报, 2015(3):10.