PANC-1/GEM 人胰腺癌细胞吉西他滨耐药株 百欧博伟生物

PANC-1/GEM 人胰腺癌细胞吉西他滨耐药株 百欧博伟生物

一、细胞简介

平台编号：bio-106238

规格：1*10E6

拉丁属名：PANC-1/GEM 人胰腺癌细胞吉西他滨耐药株

中文名称：人胰腺癌细胞吉西他滨耐药株

细胞用途：仅供科研使用

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

二、细胞描述

该人胰腺癌细胞PANC-1来源于一名56岁白人男性。1 U/ml 左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase)可抑制其生长。此细胞可以在琼脂糖上生长。

三、细胞特性

1）来源：胰腺，胰管，上皮细胞癌

2）形态：上皮细胞样，贴壁生长

3）含量：>1x106

4）污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5）规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

四、细胞诱导构建实验步骤

1、MTT 法检测 PANC-1 对吉西他滨的 IC50将处于对数生长期的 PANC-1 细胞传代后，以 6000/孔的密度接种在 96 孔板里，待细胞生长稳定后，将培养基更换为含不同浓度吉西他滨的培养基，浓度依次为 0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。置于含 5%CO2、饱和湿度的 37℃恒温细胞培养箱中培养 72h。取出 96孔板，每孔加入 20ul MTT（5 mg/mL）溶液加入到每个培养孔中，继续培养 4 h。4 h 后，取出 96 孔板，吸除培养基，排枪每孔加入 150 µL Formazan 溶液，置摇床上低速振荡 10-30min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在 OD 570nm 处测量各孔的吸光值，分析实验结果，得出 IC50 为 0.9μg/mL，则选择此浓度作为 PANC-1耐药株诱导的起始浓度。

2、PANC-1 细胞耐药分步诱导取处于对数生长期的 PANC-1 细胞，加入含 0.9μg/mL 吉西他滨的培养基，置于含 5%CO2、饱和湿度的 37℃恒温细胞培养箱中培养。隔日换液（同浓度含药培养基），待细胞可以稳定生长后加大药物浓度，每次增加 2 倍，直至 10 个月后，细胞可以在含 18μg/mL 吉西他滨的培养基保持稳定生长 4day，视为细胞耐药成功，并命名为 PANC-1/GEM。

五、细胞的运输和保存

可选择干冰运输及发送复苏存活细胞方式

（1）干冰运输，收到后立即转入液氮冻存或直接复苏；

（2）存活细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存。具体操作见细胞培养步骤。

六、注意事项

1、收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

2、收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放在培养箱静置2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收细胞时就整体外观拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，随后在显微镜下拍下细胞状态，100*，200*各一张），观察记录细胞在运输过程中是否有污染情况。作为我方进行销售依据。

3、由于细胞状态受环境、操作和运输等多方面因素影响，故本公司只保证客户收到细胞后一周内的细胞状态，故客户需要售后时需出示收到细胞的时间证明及客户提供收货时间和发现问题后客服人员沟通的时间证明，期间间隔时间不能大于7天。

4、所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。

七、细胞接收后的处理方法

1）收到细胞后，请检查发货培养瓶的状况，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）在显微镜下确认细胞生长状态时，在低倍镜（4或5X物镜)下进行，能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X和20×物镜下，同时给刚收到的细胞拍照，（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为细胞需要售后时提供收到细胞时细胞状态的依据。

3）观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h。

4）贴壁细胞：在运输过程中贴壁细胞会有脱落的现象，如发现贴壁细胞有脱落或者脱落后抱团生长，可将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和未贴壁细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到加有按照说明书细胞培养条件新配制的培养基的原培养瓶中（或新的培养瓶中）。

5）悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的培养基）。

6）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1：2传代。                 

八、细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基（含NaHCO3 1.5g/L；GIBCO,货号12800017，添加NaHCO3 1.5g/L)；优质胎牛血清，10%；L-glutamine(推荐gibco货号：35050-061)，2mM；双抗，1%；（可在培养基中加入耐药浓度18ug/ml的GEM)

2）细胞在传代和刚复苏时较为脆弱，中止液须为不含GEM的培养基，且在细胞未贴壁期间和贴壁前期需用不含GEM的培养基，待细胞生长状态稳定时再根据需要浓度添加 GEM。

3）若细胞生长状态较为缓慢时，可适当降低GEM的浓度，或使用不含GEM的培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的GEM浓度。

4）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

5）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

①弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

②加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

③按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

④将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml，细胞变圆脱落后，加入2ml培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。