豚鼠特征蛋白2(FLOT2) ELISA 试剂盒  

本试剂仅供研究使用      

实验目的：

本试剂盒用于测定人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中白介素6(IL-6)的含量。

实验原理：

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人白介素6(IL-6)水平。用纯化的白介素6(IL-6)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入白介素6(IL-6)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中白介素6(IL-6)含量。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

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操作步骤

1. 标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。

4. 温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

5. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

6. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

豚鼠特征蛋白2(FLOT2) ELISA 试剂盒  

计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项：

1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。样本在使用前也要在室温平衡60分钟。

2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物请避光保存。

7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9. 本试剂不同批号组分不得混用。

ELISA试剂盒运用应当留心哪些事项
1、ELISA试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可运用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2、浓洗刷液可能会有结晶分出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗刷时不影响效果。
3、各步加样均应运用加样器，并常常校正其准确性，以避免实验过失。一次加样时刻最好控制在5分钟内，如标本数量多，举荐运用排枪加样。
4、请每次测定的一同做规范曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于规范品孔孔OD值的)，请先用样品稀释液稀释必定倍数(n倍)后再测定，核算时请最终乘以总稀释倍数(×n×5)。
5、严格按说明书的操作进行，ELISA试剂盒效果判定有必要以酶标仪读数为准.
6、本试剂不同批号组分不得混用。
7、封板膜只限一次性运用，以避免穿插污染。
8、悉数样品，洗刷液和各种废弃物都应按感染物处理。
9、底物请避光保存。

技术提示：

1、混合蛋白溶液时，避免起泡。

2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。

3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。

4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。

5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。

6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。

8、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。

试剂盒性能：

1. 样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。

2. 批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。

如何处理ELISA测定抗体疫苗之实验数据
        在ELISA试剂盒试验中我们总是碰到许多关于数据处理的难题，为了能我们更多更具体的了解在试验中数据处理的问题，下面一起来看看ELISA测定抗体之怎么处理试验数据。
        ELISA做得很好的话批间CV都要有10～15％左右，用同一个抗原，但对于包被的抗原浓度对OD的影响不是很大，只要不是不同太大即可。抗血清当然要用同一个稀释度了。别的比较的话就必每批，每块板上的样品都要伴随着一个参比品一同做，参比品仍是同一个这样才干确保试验成果的可比性。
剖析：
（1）将同一只动物免疫不同时刻后抗体产生的效价进行比较。
（2）由上面能够得出一组数据，举个比如即如某个免疫间期抗体升高2倍的有多少，升高4，8，16...的各有多少，然后可知大多数情况下可升高多少，即此种升高率的阳性率，然后再用泊松散布证明此阳性率是否赞同整体在这个免疫间期增高的阳性率，仍是由于随机误差的原因使试验得到了这个成果。
（3）计算出不同间期的效价水平后，能够用方差剖析进行整体比较，证明不同间期免疫的作用差异是否有计算学含义；然后再两两之间进行比较，看免疫作用*显着的是哪个间期。

保存条件及有效期：

1. 试剂盒保存： 2-8℃。

2．有效期： 6个月